(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210641794.4 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 四川农业大 学 地址 611130 四川省成 都市温江区惠民路 211号 (72)发明人 欧旭敏　董静文　程安春　潘秋卫　 汪铭书　彭文婧　林晓铭　 (74)专利代理 机构 成都玖和知识产权代理事务 所(普通合伙) 51238 专利代理师 胡琳梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂 盒 (57)摘要 本发明涉及一种tRNA氨酰化水平定量qPCR 检测方法及试剂盒， 包括： (1)抽提总RNA,其中 tRNA不去氨基酸； (2)总RNA中tRNA去氨基酸， 得 到含有全部脱酰化tRNA的总RNA； 二者分别与相 同tRNA接头连接、 反转录后进行qPCR检测， 其Ct 值的差值 即指示tRNA的氨酰化水平， 通过与内参 基因校正和数据标准化处理， 即可计算tRNA的氨 基酸载量水平。 此外， 本发明创新性的提出了简 易的将细胞核和线粒体转录的全部tRNA和mRNA 共反转录方法， 克服了tRNA氨酰化检测的技术壁 垒， 使用常规qPCR技术 即可实现tRNA氨酰化水平 的定量检测。 权利要求书1页 说明书10页 序列表32页 附图3页 CN 114836548 A 2022.08.02 CN 114836548 A 1.一种tRNA 氨酰化水平定量qPCR检测方法， 其特 征在于， 所述方法包括： (1)抽提总RNA； (2)所述抽提的总RNA中tRNA去氨基酸， 得到含有全部脱酰 化的tRNA； (3)将步骤(1)和步骤(2)所 得总RNA分别进行如下步骤： A.与独特接头序列混合、 孵育后， 得到含有接头连接的t RNA混合液； 所述独特接头序列 与去氨酰 化tRNA尾部的AC C连接； B.所述混合液加入可结合独特接头的通用特异性下游引物配置成退火溶液， 连接tRNA 退火化； C.退火化的连接tRNA与mRNA共反转录得到 cDNA； D.qPCR检测： 上游引物为tRNA反密码子特异性的引 物， 下游引物为所述可结合独特接 头的通用特异性下游引物； 所述cDNA经qPCR检测得Ct值； 二者Ct值的差值即tRNA的氨酰化 水平。 2.按照权利要求1所述t RNA氨酰化水平定量qPCR检测方法， 其特征在于， 所述独特接头 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 可通用于人类、 鸡或鸭细胞的核或线粒体tRNA氨 酰化水平 的定量检测。 3.按照权利要求2所述t RNA氨酰化水平定量qPCR检测方法， 其特征在于， 可结合独特接 头的通用特异性下游引物如SEQ  ID NO.2所示。 4.按照权利要求1所述t RNA氨酰化水平定量qPCR检测方法， 其特征在于， 所述上游引物 为SEQ ID NO.3所示， 可通用于人类、 鸡或鸭细胞总tRNA 氨酰化水平的定量检测。 5.按照权利要求2所述t RNA氨酰化水平定量qPCR检测方法， 其特征在于， 所述人类细胞 核中每种tRNA， 上游引物分别为SEQ  ID NO.4～60所示； 所述人类线粒体中每种tRNA， 上游 引物分别为SEQ  ID NO.137～158所示。 6.按照权利要求2所述t RNA氨酰化水平定量qPCR检测方法， 其特征在于， 所述鸡细胞核 中每种tRNA， 上游引物分别为SEQ  ID NO.61～103所示； 所述鸡线粒体中每种tRNA， 上游引 物分别为SEQ  ID NO.159～180所示。 7.按照权利要求3所述t RNA氨酰化水平定量qPCR检测方法， 其特征在于， 所述鸭细胞核 中每种tRNA， 上游引物分别为SEQ  ID NO.61～73和SEQ  ID NO.104～136所示； 所述鸭线粒 体中每种tRNA， 上游引物分别为SEQ  ID NO.181～ 202所示。 8.用于人类、 鸡或鸭总t RNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒， 其特征在于， 包括核苷 酸序列如SEQ  ID NO.1所示的接头、 如SEQ  ID NO.2所示的通用特异性下游引物和如SEQ  ID  NO.3所述上游引物。 9.用于人类细胞核中每种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒， 其特征在于， 包括 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的接头、 如SEQ  ID NO.2所示的通用特异性下游引物和如 SEQ ID NO.4～60所述上游引物。 10.用于人类线粒体中每种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒， 其特征在于， 包括 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的接头、 如SEQ  ID NO.2所示的通用特异性下游引物和如 SEQ ID NO.137～158所述上游引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836548 A 2tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方 法及试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于分子生物化学技术领域， 具体涉及一种tRNA氨酰化水平定量qPC R检测 方法及试剂盒。 背景技术 [0002]tRNA是氨基酸的载体， 主要参与遗传密码的识别， 是联系 mRNA和蛋白表达的重要 分子。 目前已知人、 鸡、 鸭细胞核基因组中分别编码有415、 271、 361个tRNA 基因； 但其线粒体 基因组均编码22种tRNA。 由于tRNA分子片段较小， 大约在73 ‑96nt左右， 常规方法不能检测 此类小RNA分子。 此外tRNA在细胞内参与mRNA翻译实际是以氨 酰化tRNA的形式而发挥功能， 目前tRNA主 要有如下几个特 征导致tRNA检测及其氨酰 化水平检测存在困难： [0003]第一、 所有成熟tRNA的3 ’末端的CCA中的腺嘌呤核糖2 ’羟基和3’羟基是氨基酸分 子中氨基连接的实际位置， tRNA  3’末端氨酰化妨碍了tRNA与接头的5 ’,3’磷酸二酯键的催 化。 [0004]第二、 tRNA含大量的转录后碱基修饰， 尤其是反密码子中的第34位， 但其反密码子 35、 36位极少被修饰； [0005]第三、 人、 鸡、 鸭细胞核D NA中编码了冗余的tRNA基因拷贝， 高通量检测所有tRNA十 分繁杂； [0006]第四、 人、 鸡、 鸭除细胞核DNA编码有大量tRNA基因， 其线粒体基因组也编码有tRNA 基因， 其数量较少， 均为2 2种， 其中亮氨酸和丝氨酸有两种， 其 余均为一种。 [0007]第五、 tRNA分子短， 结构复杂， 常规方法获得cDNA步骤冗长， 大大限制tRNA检测方 法的应用。 [0008]第六、 细胞内实际参与翻译功能的tRNA是氨酰化形式的tRNA， 但细胞内同时存在 氨酰化的tRNA和未氨酰 化的tRNA， 常规手段不能专一检测tRNA的氨酰 化水平。 [0009]目前虽然tRNA检测和tRNA氨酰化的高通量测 序的检测方法已经建立了， 但是其试 验设备依赖性强、 试验周期长、 价格昂贵， 大 大的限制了tRNA生物学功能的研究。 [0010]qPCR技术由美国Applied  Biosystems公司于1996年推出， 其作为一个极有效的实 验方法， 已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。 目前尚没有使用常规qPCR技术实 现氨酰化水平检测相关方法的报道。 发明内容 [0011]有鉴于此， 为了克服现有技术 的不足， 本发明提供一种tRNA氨酰化水平定量qPCR 检测方法， 所述方法包括： [0012](1)抽提总RNA； [0013](2)所述抽提的总RNA中tRNA去氨基酸， 得到含有 脱酰化tRNA的总RNA； [0014](3)将步骤(1)和步骤(2)所 得总RNA分别进行如下步骤： [0015]A.与独特接头序列混合、 孵育后， 得到含有连接tRNA的混合液； 所述独特接头序列说　明　书 1/10 页 3 CN 114836548 A 3