(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210575416.0 (22)申请日 2022.05.25 (71)申请人 成都仕康美生物科技有限公司 地址 610000 四川省成 都市成都高新区科 园南路88号9栋3层301号 (72)发明人 魏亮　 (74)专利代理 机构 成都市集智汇华知识产权代 理事务所(普通 合伙) 51237 专利代理师 陈慕华 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 SNP位点及其引物、 探 针和检测试剂盒 (57)摘要 本发明公开了24个SNP位点以及所述SNP位 点在制备评估实体器官移植术后移植物损伤及 排斥风险的产品中的应用。 本发明研究发现， 将 上述24个SNP位点作为检测靶点， 计算得到的总 游离DNA中供体游离DNA的含 量， 即GcfDNA供者含 量比， 能够准确反映出移植排斥的程度， 为临床 检测实体器官移植术后移植物损伤和排斥风险 提供了一种简单而有效的检测手段。 为此， 本发 明还提供了用于检测所述SNP位点的引物和探 针， 以及包括所述引物和探 针的试剂盒。 权利要求书2页 说明书15页 序列表15页 CN 115261455 A 2022.11.01 CN 115261455 A 1.SNP位点， 所述SNP位点为rs2242301、 rs1318、 rs748384、 rs260502、 rs1210635、 rs1038394、 rs26801、 r s2075386、 rs2242349、 r s1039322、 rs803092、 r s1800738、 rs854792、 rs1805790、 rs730121、 rs1124119、 rs1882881、 rs2235116、 rs2235148、 rs742018、 rs2028566、 rs332 04、 rs1040383、 rs2235512的组合， 所述SNP位点用于评估实体器官移植术 后移植物损伤及排斥风险， 实体 器官包括 肝、 肾、 心、 肺。 2.权利要求1所述的SNP位点在制备评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的 产品中的应用， 实体器官包括肝、 肾、 心、 肺， 所述SNP位点为rs2242301、 rs1318、 rs748384、 rs260502、 rs1210635、 r s1038394、 rs26801、 r s2075386、 rs2242349、 r s1039322、 rs803092、 rs1800738、 rs854792、 rs1805790、 rs730121、 rs1124119、 rs1882881、 rs2235116、 rs2235148、 rs742018、 rs20285 66、 rs33204、 rs1040 383、 rs2235512的组合。 3.一种用于评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的引物和探针， 所述引物为 SEQ ID No.1‑48所示的序列， 所述探针为SEQ  ID No.49‑96所示的序列； 所述SEQ  ID No.1‑ 48所示的引物和SEQ  ID No.49‑96所示的探针用于扩增、 检测权利要求1中所述的24个SNP 位点。 4.一种权利要求3所述的引物和探针在制备评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥 风险的产品中的应用。 5.一种用于评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂 盒， 所述试剂 盒中包 括SEQ ID NO.1‑48所示的引物和SEQ  ID NO.49‑96的探针； 所述SEQ  ID No.1‑48所示的引 物和SEQ ID No.49‑96所示的探针用于扩增、 检测权利要求1中所述的24个SNP位 点。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述探针的5 ’端均连接报告荧光基团， 其中任意12个SNP位点的探针对5 ’端分别连接FAM和VIC/HEX/JOE/TEX的报告荧光基团； 另 外12个SNP位点的探针对5 ’端分别连接ROX和CY5的报告荧光基团； VIC/HEX/JOE/TEX ”表示 VIC、 HEX、 JOE、 TEX中的一种； 所述探针的3 ’端标记淬灭荧光基团， 淬灭荧光基团为NFQ或者 MGB。 7.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中还包括PCR技术常用的试 剂， 如ddPCRTMProbeSupermix和超纯 水。 8.一种检测总游离DNA中供者游离DNA含量的方法， 包括如下步骤： 步骤1： 以待测样品的总游离DNA为模板， 分别将5 ’端标记FAM和VIC/HEX/JOE/TEX的一 个SNP位点的探针对及其对应的引物， 和5 ’端标记ROX和CY5的一个SNP位点的探针对及其对 应的引物加入到一个反应体系中， 制备得到一管数字PCR反应微滴； 依此方式共制备得到12 管数字PCR反应微 滴进行数字PCR反应， ； 步骤2： 反应结束后， 分析每一管中的SNP位点， 计算GcfDNA供者含量比， 即供者游离 DNA/总游离DNA的比值； 其中， GcfDNA供者含量比的分析计算方法如下： 若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9 ‑1， 视该位 点数据为无效数据； 若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0， 即仅有一种碱基阳性， 视该位点数据为无 效数据； 若该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0 ‑0.9， 视该位点数据为有效数据； 在有效数 据中， 以SNPNo#1和SNPNo#2为例， SNPNo#1的碱基比约等于SNPNo#2的两倍(2 ±0.4)， 则判定权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261455 A 2SNPNo#1中， 移植受者和移植供者均为纯合子； 在SNPNo#2中， 移植受者为纯合子， 移植供者 为杂合子； 选择判定移 植受者和移 植供者均为纯合子的SNP位点， 采用碱基低含量/总含量， 计算得到该位点的供者含量比值， 再将所有符合该条件SNP位点的比值求平均值， 即为 GcfDNA供者含量比。 9.根据权利要求8所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤1中待测样品为血液或者尿 液。 10.根据权利要求8所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤1中数字PCR反应的反应体 系为： 成分 体积 ddPCRTMProbeSupermix 10 μL 一个SNP位 点的引物和探针 各0.25 μL， 共0.5 μL 另一个SNP位 点的引物和探针 各0.25 μL， 共0.5 μL 总游离DNA 2 μL 超纯水 7 μL 共计 20 μL 所述PCR反应程序如下： 95℃、 10min预变性； 95℃、 15s， 57℃、 1min， 40个循环； 95℃保持 10min； 10℃保存。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261455 A 3