(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210617602.6 (22)申请日 2022.06.01 (71)申请人 安徽省农业科 学院畜牧兽医研究所 地址 230000 安徽省合肥市农科南路40号 (72)发明人 王洁茹　殷冬冬　戴银　尹磊　 刘林清　潘孝成　王重龙　沈学怀　 胡晓苗　侯宏艳　赵瑞宏　周学利　 (74)专利代理 机构 合肥东邦滋原 专利代理事务 所(普通合伙) 3415 5 专利代理师 王天马 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/113(2010.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 RPA引物对及其应用、 可视化检测PCV4的试 剂盒及其应用和检测PCV4方法 (57)摘要 本发明属于猪圆环病毒4型核酸的可视化检 测领域， 具体涉及RPA引物对及其应用、 可视化检 测PCV4的试剂盒及其应用和可视化检测PCV4的 方法； 所述RPA引物对是由RPA  F和RPA R组成的 引物对， 其中， 所述RPA  F的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1所示， 所述RPA  R的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.2所示。 本发明提供的试剂盒具有特异性良好 且检测限低的优点， 能够快速定性检测PC  V4。 且 本发明试剂盒判读方法直观， 且与其他家禽病毒 没有交叉反应。 可实现PCV4的高灵敏度、 高特异 性检测。 可对猪圆环病毒4型的早期检测及后期 流行病学调查提供了技术支 撑， 对该病的防控具 有指导意义。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 115141826 A 2022.10.04 CN 115141826 A 1.一种RPA引物对， 其特征在于： 所述RPA引物对是由RPA  F和RPA R组成的引物对， 其 中， 所述RPA  F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述RPA  R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2 所示。 2.权利要求1所述的RPA引物对在制备检测或诊断可视化PCV4中的应用。 3.一种可视化检测PCV4的试剂盒， 其特征在于： 所述的试剂盒包含： RPA引 物对、 crRNA 引导序列和目标DNA片段； 所述RPA引物对为权利要求1所述的RPA引物对。 4.根据权利要求3所述的可视化检测PCV4的试剂盒， 其特征在于： 所述crRNA引导序列 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 5.根据权利要求3所述的可视化检测PCV4的试剂盒， 其特征在于： 所述目标DNA片段通 过所述RPA引物对 扩增目的基因 组DNA而获得。 6.根据权利要求5所述的可视化检测PCV4的试剂盒， 其特征在于： 所述目标DNA片段为 PCV4的Cap基因的扩增序列； 所述Cap基因的扩增序列如SEQ  ID No.4。 7.根据权利要求3所述的可视化检测PCV4的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒还含有 Cas13a蛋白、 NTP  buffer mix、 T7 RNA polymerase  mix、 RNase  inhibitor、 RNA  Reporter、 PCV4质粒 标准品、 猪圆环病毒4型质粒 标准品和横向流动试纸条中的至少一个。 8.根据权利要求7中任意一项所述的可视化检测PCV4的试剂盒， 其特征在于： 所述 Cas13a蛋白为LwCas13a核酸酶。 9.权利要3 ‑8中任意一项所述的试剂盒在制备检测或诊断可视化检测PCV4中的应用。 10.一种可视化检测PCV4的方法， 其特 征在于： 所述方法包括： A、 从待测组织或血清样本中获得PCV4基因 组DNA； B、 以PCV4基因组DNA为打靶位点， 按照重组酶聚合酶扩增技术RPA的设计原则设计RPA 扩增引物， 并通过RPA等温扩增技 术扩增PCV4基因 组DNA， 得到待检测的PCV4基因 组DNA； C、 将待检测的PCV4基因组DNA与权利要3 ‑8中任意一项所述的试剂盒里提供的试剂按 体系混合并孵育； 利用横向流动试纸条稀释液将检测产物稀释后， 加载到横向流动试纸条 上， 放置3‑5分钟， 根据显色条 带进行结果判定 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115141826 A 2RPA引物对及其应用、 可视化检测PCV4的试剂盒及其应用和检 测PCV4方 法 技术领域 [0001]本发明属于猪圆环病毒4型核酸的可视化检测领域， 具体地说， 本发明涉及 猪圆环 病毒4型核酸的检测， 尤其涉及RPA引物对及其应用、 可视化检测  PCV4的试剂盒及其应用和 可视化检测PCV4的方法。 背景技术 [0002]猪圆环病毒(PCV)是一种无囊膜的环状DNA病毒， 属于圆环病毒科、 圆环病毒属。 分 为四种血清型(PCV1 ‑4)。 PCV4可引起猪呼吸道疾病综合征、 猪 皮炎和肾病综合征、 心肌炎和 母猪繁殖障碍等疾病。 PCV4临床上常与其它病毒混合感染， 导致患病猪死亡率显著增高 (25％‑40％)， 为了预防疾病的传出和控制病毒的传播， 精准 监测极为重要。 [0003]准确、 快速的检测是减少其传播扩散的重要手段。 目前， 对于PCV4的检验通常采用 病毒分离鉴定、 常规PCR， 荧光定量PCR等。 普通PCR检测时间长， 病毒分离鉴定、 荧光定量P CR 等需要专业的设备和技术人员。 基于CRISP R ‑Cas13a系统结合可视化试纸条的检测方法， 以其高灵敏度， 高特异性且适应现场快速检测， 准确检测的需要， 为流行病学 的调查， 掌握 传播规律以及疫病的诊断和防控提供有力支持。 发明内容 [0004]本发明的目的是针对现有技术存在的PCV4检测时间长、 专业性高以及灵敏度低的 不足， 提供了RPA引物对及其应用、 可视化检测PCV4的试剂盒及其应用和可视化检测PCV 4的 方法， 该方法具有灵敏度高、 特异性强、 操作简便、 检测时间短， 结果可肉眼观察的优点， 弥 补了常规检测方法的不足， 对于圆环病毒的防控和治疗有很好的实用价 值。 [0005]为实现上述目的， 本 发明第一方面提供一种RPA引物对， 所述RPA引物对是由RPA  F 和RPA R组成的引物对， 其中， 所述RPA  F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述RPA  R的核 苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 [0006]本发明第二方面 提供所述的RPA引物对在制备检测或诊断可视化PCV4中的应用。 [0007]本发明第三方面提供一种可视化检测PCV4的试剂盒， 所述 的试剂盒包含：  RPA引 物对、 crRNA引导序列和目标DNA片段； 所述RPA引物对为权利要求  1所述的RPA引物对。 [0008]优选地， 所述crRNA引导序列的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 [0009]优选地， 所述目标DNA片段通过 所述RPA引物对 扩增目的基因 组DNA而获得。 [0010]优选地， 所述 目标DNA片段为PCV4的Cap基因的扩增序列； 所述Cap  基因的扩增序 列如SEQ ID No.4。 [0011]优选地， 所述试剂盒还含有Cas13a蛋白、 NTP  buffer mix、 T7 RNA polymerase mix、 RNase  inhibitor、 RNA  Reporter、 PCV4质粒标准品、 猪圆环病毒 4型质粒标准品和横向 流动试纸条中的至少一个。 [0012]优选地， 所述Cas13a 蛋白为LwCas13a核酸酶。说　明　书 1/5 页 3 CN 115141826 A 3