(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221073262 2.8 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 北京农学院 地址 102208 北京市昌平区回龙观镇北农 路7号 (72)发明人 阮文科　张博文　徐胜奎　姚劼林　 夏婷　 (74)专利代理 机构 西安铭泽知识产权代理事务 所(普通合伙) 61223 专利代理师 崔瑞迎 (51)Int.Cl. A61K 39/145(2006.01) A61P 31/16(2006.01) C07K 14/11(2006.01) C12N 15/44(2006.01)C12N 15/63(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方法 与应用 (57)摘要 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一 种H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方法与 应用。 具体 涉及H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫 苗的 制备和安全性和免疫效力的评估。 本发明所述 H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫 苗安全有效， 可以在 SPF鸡体内诱发强烈的体液免疫以及细胞免疫应 答， 作为一种新型疫苗在应对H9N2禽流感疫情时 有良好的前 景。 权利要求书1页 说明书8页 序列表5页 附图9页 CN 115252770 A 2022.11.01 CN 115252770 A 1.一种H9N2亚型禽 流感病毒mRNA疫苗的制备 方法， 其特 征在于， 包括： 以H9N2亚型禽 流感病毒HA全长为模板， 经 过PCR扩增得到扩增产物； 扩增产物连接入pV AX1质粒， 构建了pV AX1‑HA重组质粒； 反向PCR线性化重组质粒， 带有T7启动子的线性化质粒在T7  RNA聚合酶作用下体外转 录后得到目的片段mRNA； 通过牛痘病毒加帽系统和Po ly(A)聚合酶进行mRNA修饰， 得到mRNA疫苗。 2.根据权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法， 其特征在于， PCR 扩增所用引物为： 上游引物H9N2  HA p1： 5’ ‑GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCATG GAAGTAGCATCACTA ATAACTATACT ‑3’； 下游引物H9N2  HA p2： 5’ ‑TCCGAGCTCG GTACCAAGCTTTTATATACA AATGTTGCATCTGCA AGC‑3’。 3.根据权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法， 其特征在于， pVAX1质粒以及重组质粒酶切位 点均是Nhe Ⅰ、 HindⅢ； 反向PCR得到线性 化质粒的引物序列如下： pVAX1‑HA p1： 5’ ‑TTATATACA AATGTTGCATCTGCA AGA‑3’； pVAX1‑HA p2： 5’ ‑ATGGAAGTAGCATCACTA ATAACTATACTACTAG ‑3’。 4.根据权利 要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法， 其特征在于， 将纳 米脂质体与修饰后的mRNA自组装后制备成粒子形态的mRNA疫苗。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的制备的H9N2亚型禽 流感病毒mRNA疫苗。 6.一种针对H9N2亚型禽流感病毒的mRNA疫苗的抗原， 其特征在于， 所述抗原是HA原核 蛋白， 其抗原氨基酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 7.一种用于制备针对H9N2亚型禽流感病毒 的疫苗的mRNA， 其特征在于， 其核苷酸序列 如SEQ ID NO.2所示。 8.一种与权利要求7所述的mRNA互补的DNA， 其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3 所示。 9.一种包 含权利要求7 所述的mRNA的载体。 10.一种权利要求7 所述的mRNA在制备针对H9N2亚型禽 流感病毒的疫苗中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115252770 A 2H9N2亚型禽流感病毒mRNA疫苗及制备方 法与应用 技术领域 [0001]本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒  mRNA疫苗及 制备方法与应用。 背景技术 [0002]流感病毒为多节段单股负链有囊膜的RNA病毒， 流感病毒可根据核蛋白和基质蛋 白的抗原性差异分为A， B， C三种型， H9N2亚型禽流感病毒属于A型流感病毒， 病毒粒子由核 衣壳和病毒囊膜构成。 在亚洲的禽类中广泛传播， 病理表现为轻微的呼吸道症状， 引发继发 感染后会感染导 致死亡。 [0003]A型流感病毒基因组按照基因长度由PB2、 PB1、 PA、 HA、 NP、 NA、 M  和NS这8个负链和 单链RNA片段组成， 每种病毒基因至少编码一种蛋白。  HA是一种 三聚体形式的吸附蛋白， C 端末端的一个疏水区插入病毒囊膜中， 是血凝素蛋白与病毒囊膜结合的部位， N端末端的一 个疏水区有膜融合活性， 与病毒入侵宿主细胞有关， 还会诱导中和抗体产生和细胞免疫， 是 病毒表面的主要抗原之一。 而灭活疫苗主要诱导体液免疫， 细胞免疫较弱， 随着H9 N2病毒的 不断变异， 在各个国家都出现了疫苗接种失效的情况。 [0004]mRNA疫苗是一种将RNA在 体外进行相关的修饰后传递至机体细胞内表达并产生蛋 白抗原， 从而导致机体产生针对 该抗原的免疫应答， 进而扩大机体的免疫能力的疫苗。 与全 细菌、 亚单位和DNA疫苗等其他疫苗相比， mRNA  疫苗可以诱导T细胞和B细胞免疫反应， 并且 是非整合性和可自然降解的， 因此， 不存在感染或插入诱变的风险。 其次， 通过体外转录反 应可以快速、 廉价地合成mRNA， 因此很容易可以在短时间内大量生产。 第三， 病毒载体疫苗 成本高， 对机体免疫影响大， LNP比之相 对安全， 出现自身免疫反应几率小。 对于机体来说， 机体所产生的抗原存在时间长， 数量多， 它的特异性免疫记忆和免疫应答就越强、 越快。 mRNA疫苗从接种、 被递送到目标靶点、 呈递抗原 直至降解， 整个过程中疫苗接种量不会对抗 原数量产生较大影响， 且mRNA所呈递的抗原存在时间长， 不会迅速被消化， 十分有利于免疫 应答。 [0005]总体来说， mRNA疫苗具有研发周期短， 生产工艺简单， 易于批量生产； 研发周期短， 能够快速开 发新型候选疫苗； 安全性好， 不需要佐剂， 不含病毒成分， 无感染风险； 具有双重 免疫机制， 免疫原性强等优势， 所以mRNA疫苗 正成为对抗感染性疾病的强大平台。 发明内容 [0006]为了解决上述技术问题， 本发明提供了一种H9N2亚型禽流感病毒mRNA  疫苗及制 备方法与应用。 [0007]本发明的目的是提供一种H9N2亚型禽 流感病毒mRNA疫苗的制备 方法， 包括： [0008]以H9N2亚型禽流感病毒HA全长为模板， 经过PC R扩增得到扩增产物； 扩增产物连接 入pVAX1质粒， 构建了pV AX1‑HA重组质粒； [0009]反向PCR线性化重组质粒， 带有T7启动子的线性化质粒在T7  RNA聚合酶作用下体说　明　书 1/8 页 3 CN 115252770 A 3