(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221090183 6.3 (22)申请日 2022.07.28 (71)申请人 威海纽普生物技 术有限公司 地址 264200 山东省威海市 火炬高技 术产 业开发区山海路28 8-6号 (72)发明人 李红江　孔波　王鹏浩　王有志　 (74)专利代理 机构 威海科星专利事务所 37202 专利代理师 初姣姣 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) G01N 33/535(2006.01) G01N 33/543(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (54)发明名称 B族链球菌核酸检测试剂盒及其制造方法 (57)摘要 本发明涉及链球菌核酸检测产品制造技术 领域， 具体的说是一种结构合理、 操作 简便， 能够 在保证检测准确性的前提下， 显著降低成本及操 作复杂度的B族链球菌核酸检测试剂盒及其制造 方法， 包含样本处理液、 PCR ‑MIX、 检测缓冲液、 阴 性和阳性对照品及金标检测卡， 其特征在于， 所 述样本处理液为10mM  PBS pH 7.2、 0.05％ TritonX‑100、 0.05％Proclin ‑300， 用于拭子样 本的稀释处理； PCR ‑MIX用于PCR扩增； 检测缓冲 液为50mMTris ‑HCL 8.0、 0.1％Tween ‑20、 1％ PVP‑K30、 0.9％NaCl、 0.05％Proclin ‑300， 用于 PCR扩增产物稀释后的检测； 金标检测卡主要有 试纸条和卡壳组装而成， 其中试纸条包括预固定 有金标鼠源 抗FAM抗体的结合垫、 预包被抗BIO抗 体、 抗DIG抗体和羊抗鼠的NC膜、 吸水纸、 样品垫、 PVC底板。 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 CN 115369177 A 2022.11.22 CN 115369177 A 1.一种B族链球菌核酸检测试剂盒， 包含样本处理液、 PCR ‑MIX、 检测缓冲液、 阴性和阳 性对照品及金标检测卡， 其特征在于， 所述样本处理液为10mM  PBS pH 7.2、 0.05％ TritonX‑100、 0.05％Proclin ‑300， 用于拭子样本的稀释处理； PCR ‑MIX用于PCR扩增； 检测 缓冲液为50mM  Tris‑HCL 8.0、 0.1％Tween ‑20、 1％PVP ‑K30、 0.9％NaCl、 0.05％Proclin ‑ 300， 用于P CR扩增产物稀释后的检测； 金标检测卡主要有 试纸条和卡壳组装而成， 其中试纸 条包括预固定有 金标鼠源抗FAM抗体的结合垫、 预包被抗BIO抗体、 抗DIG抗体和羊抗鼠的NC 膜、 吸水纸、 样品垫、 PVC底板 。 2.根据权利要求1所述的B族链球菌核酸检测试剂盒， 其特征在于， 对应引物长度： 20 ‑ 25bp， 序列需满足以下要求： 碱基排布随机性高， GC含量在40％ ‑55％之间； 扩增片段避免形成二级结构而影响扩 增； 扩增片段长度在180 ‑300bp， 不超过450bp， 避免扩增序列太长引起层析检测灵敏度； 靶 标基因和内参基因上游引物5 ’端均标记FAM， 靶标基因下游引物的5 ’端标记生物素(BIO)、 内参基因下游引物的5 ’端标记地高辛(DIG)； 所述引物序列如下： 引物序列(5 ’ ‑3’) cfb‑F TGGTAGTCGTGTAGA AGCCTTA cfb‑R GATGGTAGCTCTATCAGT TGGT GAPDH‑F ACCATGAGAAGTATGACA AC GAPDH‑R CAGCTCTCATAC CATGAGTC CTT。 3.一种B族链球菌核酸检测试剂盒的制造方法， 其特征在于， 包括PCR ‑MIX配制和金标 检测卡的制备， 其中PCR ‑MIX配制为： 用无菌超纯水按照如下参数配制： 50mM  KCL、 10mM   Tris‑HCL、 2mM MgCl2、 0.2mM dNTPs、 0.1U/ μl  Taq DNA聚合酶、 靶标及内参上下游引物各10 μmol/L、 1％DMSO、 1.5％甲酰胺、 10mM一水甜菜碱， 充分混匀后， 28 μL/支分装至8联管， ﹣2 0℃ 冷冻； 所述金标检测卡制备包括以下步骤： 步骤1： 结合垫制备： 步骤1‑1： 取50ml胶体金溶液， 快速搅拌加入300 μL  0.1M K2CO3， 混匀后， 快速搅拌中加 入500 μg FAM标记抗体， 室温旋转孵 育10min； 步骤1‑2： 标记结束后， 分别向其加入5.5mL  1％PEG20000， 混匀， 室温条件下室温静置 20min， 封闭结束后， 用高速冷冻离心机10 000rpm/4℃/15mi n， 弃上清； 步骤1‑3： 加入5mL胶体金 标记物复溶液， 得5mLFAM抗体胶体金 标记工作液； 步骤1‑4： 取出结合垫， 在喷液的环境条件下放置至少平衡30min； 将划膜喷金机的喷液 参数设置为9 μl/cm， 对FAM胶体金标记工作液进行喷液包被， 喷液完成后， 将结合垫放置在 电热鼓风干燥箱42℃干燥16 ‑24小时； 步骤2： NC膜划线： 将NC膜裁剪后， 粘贴在PVC底板上， 配制划线抗体并划线包被， 如下： T1： 靶标检测线， 抗BIO抗体划线浓度1μg/ μL、 Buffer  10mM PB‑7.4； T2： 内参检测线， 抗DIG 抗体， 划线浓度1μg/μL、 Buffer  10mM PB‑7.2； C线： 质控线， 羊抗鼠多克隆抗体， 划线浓度 0.5 μg/ μL、 Buffer  10mM PB‑7.8， 划线参数为： 1μL/cm， 将划好的NC膜放置在电热鼓风干燥 箱37‑50℃干燥16 ‑24小时； 步骤3： 按以下步骤进行组装：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115369177 A 2步骤3‑1： 干燥完成后， 取出结合物垫， 用裁纸刀或宽型切条机裁剪宽度为0.8cm的条 带； 步骤3 ‑2： 用裁纸刀或宽型切条机把样品垫 裁切为宽 3.2cm/条， 吸水纸宽2.8cm/条； 步骤3‑3： 取出已包被好的PVC大板， 按照先贴吸水纸、 再贴结合垫、 最后贴样品垫的顺 序进行组装； 步骤4： 将组装好的半成品大板， 4mm/条裁切， 然后装入卡壳， 压壳后装入内包装袋封 口， 内包装袋含干燥剂， 室温储 存。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115369177 A 3