ICS 65.020.20 B21 昭 DB5306 通 市 地 方 标 准 DB5306/T 19—2019 代替 DG5306/T 19—2014 昭通市马铃薯脱毒苗生产技术规程 2019 -11 - 15 实施 2019 - 11-15 发布 昭通市市场监督管理局 发 布 DB5306/T 19—2019 前  言 本规程按照DB/T1.1－2009《规程化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本规程由云南省昭通市农业科学院提出。 本规程由昭通市农业农村局归口。 本规程起草单位：昭通市农业科学院。 本规程主要起草人：宋维际、李灿辉、张清凤、胡 祚。 本规程代替了DG5306/T 19—2014。 I DB5306/T 19—2019 昭通市马铃薯脱毒苗生产技术规程 1 范围 本规程规定了马铃薯脱毒核心苗、基础苗、栽培苗的生产技术。 本规程适用于昭通市马铃薯脱毒核心苗、基础苗、栽培苗生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB5749 生活饮用水卫生规程 GB18133 马铃薯脱毒种薯 NY/T1212 马铃薯脱毒种薯繁育技术规程 NY/T1606 马铃薯种薯生产操作技术规程 YY0569 生物安全柜 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1 脱毒核心苗 通过茎尖剥离获得的符合GB 18133 3.2 马铃薯脱毒种薯的再生苗。 基础苗 用核心苗扩繁的苗，基础苗一般为核心苗第一代起继代扩繁22代±2代，即核心苗在保苗期间继代5 代～7代，基础苗在扩繁栽培苗期间扩繁继代15代±2代。 3.3 栽培苗 用密封、透明、耐高温的材料如玻璃瓶、耐高温塑料袋作容器，以生产为目的，快速繁殖后可用于 移栽的马铃薯脱毒苗。 3.4 培养基 为马铃薯脱毒苗的生长、发育提供所需物质的支撑物。 3.5 母液 将培养基的成份配制成相应浓度的溶液或混合溶液。 3.6 接种 在无菌条件下，将处理好的植物组织材料放置到培养基上的操作过程。 1 DB5306/T 19—2019 4 脱毒种苗生产 4.1 仪器、器皿与试剂 4.1.1 仪器设备与器皿 高压灭菌锅、超净工作台、0.01 g感量天平、0.0001 g感量天平、空调、光照培养箱、冰箱、光照 培养架、紫外灯、枪状镊、专用组培剪、接种器械电热灭菌器、培养室、温度计、培养皿、带透气盖的 组培瓶、烧杯、量筒、医疗手推车、周转用箱。 4.1.2 试剂 75％酒精、甲醛、高锰酸钾、泛酸钙、氢氧化钠、盐酸、MS培养基（Murashige and Skoog, 1962） 所含试剂。 4.1.3 培养基制作 培养基制作按附录 A 进行，质量标准按附录 B 执行。 4.2 房间安排及要求 4.2.1 灭菌室 室内主要仪器设备是高压灭菌锅、空调、配制培养基的不锈钢桌、灌装机、电磁炉、水池、拖把池。 墙面及房间顶部贴墙砖，地面铺白色防滑地板砖。 4.2.2 接种室 室内主要仪器设备是超净工作台、接种器械电热灭菌器、空调、医疗手推车、40W紫外灯1～2盏。 接种室须设缓冲间于进门处与室内间距≧100 cm，用5 mm白玻璃隔断，隔断玻璃上贴警示彩条，进培养 室的门须与隔断门对角开；玻璃窗为双层密封窗，雨天降雨0.5h后可开窗换气；墙面、地面处理同4.2.1。 4.2.3 光照培养室 4.2.3.1 光照培养室建设 培养室宜建成四面为落地窗、顶部布≧50 %比例玻璃的密闭环境，墙面刮腻子灰滚白乳胶漆或贴白 墙砖；地面铺白色防滑地板砖；如顶部为全玻璃，须安装75 %遮阳网，夏季加盖一层50 %遮阳网；顶部 安装FFU；门的密封性要好，以免灰尘进入。如整体房间≥10 0㎡，应用玻璃隔开，隔断玻璃上贴警示 彩条，每个单元安装一台立柜式空调，以便节能。 4.2.3.2 培养架制作和摆放 用万能角钢（表面喷白色漆）制作成层高40 cm，长宽依光照培养室大小设计制作，层隔板用≥3.8mm 白玻璃；培养架之间摆放间距为60 cm。 4.2.4 药品室 室内主要仪器设备是药品柜、天平、冰箱，墙面、地面处理同4.2.1。 4.2.5 洗涤室 2 DB5306/T 19—2019 室内主要仪器设备是洗瓶机、洗涤池、不锈钢桌，墙面、地面处理同4.2.1。 4.2.6 贮藏室 室内主要仪器设备是货架，墙面、地面处理同4.2.1。 4.2.7 培养基储备室 室内主要仪器设备是空调，货架，墙面、地面处理同4.2.1。 4.2.8 病毒检测室 室内主要仪器设备是酶标仪、洗板机、冰箱、解剖镜、显微镜，墙面、地面处理同4.2.1。 4.2.9 生化室 室内主要仪器设备是光照培养箱、生化培养箱、冰箱，墙面、地面处理同4.2.1。 4.3 脱毒核心苗的获取 4.3.1 选材 选择种植在≧2500 m高海拔地区、具有本品种特性的优良健壮单株的薯块，或本品种的原原种50 个以上，待芽长出1 cm以上时备用。 4.3.2 高温处理 将选中的带芽薯块放置于于37 ℃～37.5 ℃的光照培养箱内9周～10周，在高温处理过程中及时拣 出腐烂或芽已全部死亡的薯块。 4.3.3 茎尖剥离 4.3.3.1 外材消毒 切下芽顶部（0.5 cm），放置于用75%酒精进行表面消毒过的烧杯中，上用干净纱布封口，置于自 来水下冲洗数小时；将冲洗过的茎尖用75%酒精消毒3 s～5 s，置于0.1%升汞（HgCl2）溶液中消毒5 min。 然后在无菌水冲洗8次～10次。 4.3.3.2 茎尖剥离 在超净工作台上、40×双筒解剖镜下用烧红冷却后的解剖针挑取茎尖顶部0.1 mm带1～2个叶原基的 组织。 4.3.4 茎尖培养 4.3.4.1 培养基 MS＋0.05mg/L NAA＋0.05mg/L 6-BA 4.3.4.2 培养条件 将培养瓶放置于≥3000 lux的洁净光照培养室内，温度22 ℃～25 ℃，光照≥12 h/d。 4.3.5 扩繁 待长成带4个～5个真叶的小植株进进行扩繁出5瓶～8瓶，每瓶10苗。操作按附录C执行。 3 DB5306/T 19—2019 4.3.6 送检 将扩繁后的瓶苗送检，检测对象为GB 18133 4.3.7 马铃薯脱毒种薯所列的病原物。 扩繁微型薯 将合格的数个茎尖苗扩繁后在防虫网室中各生产微型薯100粒以上。 4.3.8 田间签定 对各茎尖的微型薯在春季种植在二年内未种植过马铃薯的大田中进行品种真实性签定。 4.3.9 扩繁基础苗 根据计划所需苗量和栽苗时间扩繁基础苗。操作按附录C执行。 4.3.10 基础苗检测 在扩繁栽培苗前采用五点取样法，随机抽取1％～2％的基础瓶苗进行检测。检测方法应符合GB 18133 马铃薯脱毒种薯附录的要求。确认无检测对象后，方可扩繁栽培苗。 4.4 栽培苗的培养与炼苗 4.4.1 培养 把接种好的瓶苗置于22 2 ℃，光照强度3000 lux～50000 lux，光照时间≥14 h/d的培养室内进行 培养。3月～9月培养20 d左右、10月～翌年2月培养25 d左右，可获得具有5片～6片小叶、高6 cm左右 的小苗 4.4.2 炼苗 将室内培养的苗在移栽前5 d～7 d置于有遮光和控温设施的炼苗室或荫棚内炼苗，温度和光照强度 分别控制在25℃±2℃、3000lux~50000lux。 4.4.3 栽培苗质量 苗高5 cm～8 cm，茎粗≥1 mm，具有明显叶柄的小叶≥5片，根白色至浅黄色，根系完整。 4.5 栽培苗的清洗与消毒 将瓶苗取出，置于自来水中漂洗3次～4次。对附着的培养基则用拇指与食指轻压反复漂洗除去，切 不可搓捻，以防损伤苗而影响成活率。漂洗干净后即可用0.05％的高锰酸钾溶液浸泡10 min±2 min 进行消毒，也可用500倍～800倍的百菌清或甲基托布津浸泡处理。 5 组培室卫生 按附录D执行。 4 DB5306/T 19—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 培养基制作 A.1 母液配制 MS培养基母液配制表 母液 化合物 1L 用量(mg) 放大倍数 称量数(g) 母液体积(ml) 配制 1L 培养基需母液量 (ml) A NH4·NO3 1650 20 330 10000 50 KNO3 1900 380 MgSO4·7H2O 370 74 KH2PO4 170 34 CaCl·2H2O 440 88 FeSO4·7H2O 27.8 5000 5 Na2-EDTA 37.3 MnSO4·4H2O 22.3 1000 1 ZnSO4·7H2O 8.6 8.6 H3BO3 6.2 6.2 KI 0.83 0.83 Na2Mo4·2H2O 0.25 0.25 CuSO4·5H2O 0.025 0.025 CoCl2·6H2O 0.025 0.025 D 肌醇 100 1000 100 5000 5 E 盐酸硫胺素（VB1） 0.1 1000 0.1 1000 1 1000 1 B C F 1000 27.8 37.3 1000 22.3 盐酸吡哆醇（VB6） 0.5 0.5 烟酸（Vpp） 0.5 0.5 甘氨酸 2 2 泛酸钙 2 1000 2 注：母液配制要求分别溶解后再定容。在配制母液 A 时氯化钙最后加入并且溶液体积不少于总体积的 4/5。在配制母 液 B 时定容前应煮沸 30 分钟左右保证充分螯合。 A.2 A.2.1 培养基配制 培养基配方 5 DB5306/T 19—2019 马铃薯脱毒种苗生产培养基采用MS＋泛酸钙2 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.2g～5.2g/L（依琼脂粉的 强度标准定量，以不软不硬为准）。 A.2.2 琼脂粉的溶化 在洁净的不锈钢锅里加入配制体积4/5左右的清澈自来水，加入所需的琼脂粉，置于电磁炉上煮沸 直至琼脂完全溶化为止。 A.2.3 白糖的溶化 把所需的药品和蔗糖（或食用白糖）加入琼脂溶液中。 A.2.4 定容 加入清澈的自来水并最终定容至所需体积。 A.2.5 调整pH值 充分混合后用1 N的KOH（NaOH）或HCl调整pH值至5.8～6.0。 A.2.6 核查各种物质 仔细检查各添加物品是否完全、正确，如无遗漏或差错即可分装