(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211143447.5 (22)申请日 2022.09.20 (71)申请人 复旦大学附属中山医院 地址 200032 上海市徐汇区医学院路13 6号 (72)发明人 朱铠　刘刚　明杨　李军　冯思思　 赖颢　程蕾蕾　王春生　 (74)专利代理 机构 上海申汇 专利代理有限公司 31001 专利代理师 翁若莹 (51)Int.Cl. C12M 1/00(2006.01) C12M 3/00(2006.01) C12M 1/36(2006.01) C12M 1/14(2006.01) C12M 1/04(2006.01)C12M 1/24(2006.01) C12N 5/074(2010.01) C12N 5/077(2010.01) C12Q 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种基于诱导多能干细胞构建的全主动脉 类器官芯片模型及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于诱导多能干细胞构 建的全主动脉类器官芯片 模型及其应用。 本发明 结合多能诱导干细胞技术， 诱导 分化出三种胚胎 起源特异性血管SMC(NC ‑SMCs、 LM ‑SMCs和PM ‑ SMCs)， 分化的三胚层SMC分别培养在具有 三层结 构的芯片的细胞培养腔中， 可以模拟不同解剖主 动脉节段， 应用微流控技术及可控制的真空/气 压提供系统， 构建出了可以控制平滑肌细胞的机 械张力、 节律和频率的芯片系统， 成功构建了全 主动脉类器官芯片模型， 并用于主动脉疾病分子 机制研究及潜在药物的筛选。 该主动脉类器官芯 片模型能够完全模拟不同解剖主动脉节段的异 质性， 可用于研究主动脉疾病节段异质性发病机 制和进行有效药物筛 选。 权利要求书2页 说明书10页 附图6页 CN 115353951 A 2022.11.18 CN 115353951 A 1.一种基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型， 其特征在于， 包括主动脉 类器官芯片以及电磁阀控制器、 真空气体泵、 气体电磁阀、 真空过滤器和蠕动泵， 所述主动 脉类器官芯片包括模拟不同解剖主动脉节段 的第一芯片、 第二芯片和第三芯片， 所述第一 芯片、 第二芯片和 第三芯片均包括由上至下依次设置的三层芯片骨架， 其中， 所述芯片骨架 的上、 下两层分别开设有气体通道、 中间层开设有液体通道， 相邻芯片骨架间设置有弹性 膜， 所述弹性膜与各层通道形成位于中间的细胞培养腔和位于所述细胞培养腔两侧的真空 腔， 所述各芯片的液体通道的两端端部设置有用于与外部连接的管道接口， 所述各芯片的 上、 下层气体通道相错 开的端部设置有用于与外 部连接的管道接口； 所述第一芯片、 第二芯片和第三芯片的液体通道依次串联后与蠕动泵连接； 所述第一 芯片、 第二芯片和 第三芯片的各真空腔依次连接真空过滤器、 气 体电磁阀和真空气 体泵， 所 述气体电磁阀与电磁阀控制 器连接， 所述第一芯片、 第二芯片和第三芯片的气体通道形成 并联结构； 人源诱导多能干细胞定向分化的三胚层血管平滑肌细胞LM ‑SMC、 NC‑SMC、 PM‑SMC分别 种植于第一芯片、 第二芯片和第三芯片的细胞培养腔的弹性膜上， 用蠕动泵进行培养液 的 更换， 模拟血液流动， 电磁阀控制器控制气体电磁阀的开闭， 模拟细胞 受到的生理性周期性 张力和节律。 2.如权利要求1所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型， 其特征在 于， 所述三胚层血管平滑肌细胞是由外周血细胞(peripheral  blood mononuclear  cell, PBMC)重编程 为人源诱 导多能干细胞后， 再 经过定向分化培 养得到。 3.如权利要求1所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型， 其特征在 于， 所述芯片骨架由P DMS材料制成， 所述弹性膜为P DMS膜。 4.如权利要求1所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型， 其特征在 于， 所述管道接口包括软 管和套设于所述软 管内的不锈钢针管。 5.如权利要求1所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型， 其特征在 于， 所述真空气 体泵包括依次连接的泵体、 水油分离器和真空调压阀， 所述真空调压阀与气 体电磁阀连接 。 6.如权利要求2所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型， 其特征在 于， 所述人源诱 导多能干细胞定向分化的三胚层血 管平滑肌细胞的方法包括如下步骤： 步骤1： 用重编程试剂盒将收集的外周血细胞重新编程； 步骤2： 之后将转染的细胞重新铺板在涂有玻连蛋白的培养皿上， 并在E8培养基中培 养， 每隔一天更 换一次培 养基； 步骤3： 当克隆株细胞形态变大且没有克隆融合的情况下， 挑选并收集单克隆干细胞， 铺在涂有Matrigel的多孔板上， 并在mTeSR1培养基中扩增培养， 每天更换培养基； 然后用 Accutase细胞消化液消化细胞， 并使用ROCKi培养液以1： 5至1： 7的比例每5 ‑7天传代一次， 获得人源诱导多能干细胞； 步骤4： 步骤3重编程培养得到的人源诱导多能干细胞定向分化为三胚层血管平滑肌细 胞LM‑SMC、 NC‑SMC、 PM‑SMC； 其中， 对于LM ‑SMC的分化采用的是CDM2培养基诱导分化， 所述CDM2培养基是由IMDM和 F12培养基按照质量比1： 1的比例混合后与2mM  GlutaMAX、 1％v/v化学定义脂质浓缩物、 聚权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115353951 A 2乙烯醇1mg/mL、 胰岛素 7 μg/mL、 转铁蛋白15 μg/mL和单硫代 甘油450 μM混合制成； 对于NC‑SMC的分化采用的是含有Y276 32的培养基中诱 导分化； 对于PM‑SMC的分化采用的是含有DMEM/F12、 1XB27补充剂、 1％pen/strep、 1 ‑ thioglycero l 400 μM、 PDGF‑BB 10ng/mL和TGF ‑β 2ng/mLhiP SCs的混合培 养基诱导分化。 7.如权利要求6所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型， 其特征在 于， 所述人源诱导多 能干细胞定向分化为LM ‑SMC的过程包括： 人源诱导多 能干细胞铺板过 夜后， 用Dulbecco改良的Eagle培养基DMEM/F12清洗hiPSC， 并在补充有激活素A  30ng/mL、 BMP4 40ng/mL、 CHIR99021  6μM、 FGF2  20ng/mL和PIK90  100nM的培养基中培养24小时， 随 后， 获得的中间原始细胞用DMEM/ F12 Gibco洗涤， 并在补充有A83 ‑01 1 μM、 BMP4  30ng/mL的 CDM2培养基中向侧中胚层分化和C59  1 μM中培养24小时或48小时， 最后， 将LM细胞解离或直 接在含有P DGF‑BB 10ng/mL和TGF ‑β 2ng/mL的CDM2培 养基中培 养7天； 所述人源诱导多能干细胞定向分化为NC ‑SMC的过程包括： 将hiPSCs接种在含有Y27632   10 μM的TesRE8培养基中， 两天后， 在含有Y27632的培养基中诱导细胞分化 成神经嵴， 然后在 含有DMEM/F12、 1XN2补充剂、 0.1％牛血清 白蛋白、 1％青霉素/链霉素、 SB431542  10μM和 LDN193189 1 μM的培养基中培养6天， 其中， 在第2 ‑6天将CHIR99021添加到分化培养基中， 最 后， 在含有DMEM/ F12、 20％敲除血清替代物、 PDGF ‑BB10 ng/mL和TGF ‑β 2ng/mL的培养基中持 续培养6至8天； 所述人源诱导多能干细胞定向分化为PM ‑SMC的过程包括： 将hiPSC接种在含有Y27632   10μM的TesRE8培养基中， 第二天， 在含有DMEM/F12、 1XB27补充剂、 1％pen/strep、 BMP4   25ng/mL、 CHIR99021  8 μM、 抗坏血酸50 μg/mL和1 ‑硫代甘油400 μM的培养基中持续培养3天， 然后， 将PM细胞解离并接种到含有DMEM/F12(Gibco)、 1XB27补充剂、 1％pen/strep、 1 ‑ thioglycero l 400 μM、 PDGF‑BB 10ng/mL和TGF ‑β 2ng/mL的PM ‑SMC诱导培养基中培 养7天。 8.权利要求1～5中任意一项所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模 型在研究不同拉伸张力和节律对胚胎起源特异性SMC形态、 排列及细胞表型 的影响中的应 用。 9.权利要求1～5中任意一项所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模 型在主动脉疾病节段异质性发病机制的研究中的应用。 10.权利要求1～5 中任意一项所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模 型在主动脉疾病的分子 机制研究及药物筛 选中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115353951 A 3