(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211236442.7 (22)申请日 2022.10.10 (71)申请人 中国人民解 放军火箭军特色医学中 心 地址 100088 北京市西城区新外大街16号 (72)发明人 欧红玲　马盈盈　王岩　张巧云　 宋秀军　时磊　白静　刘晨　 (74)专利代理 机构 北京沃知思真知识产权代理 有限公司 1 1942 专利代理师 邓巧莲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12M 1/34(2006.01) C12M 1/00(2006.01) B01L 3/00(2006.01) (54)发明名称 一种基于环介导等温扩增技术的病原菌检 测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于环介导等温扩增技 术的病原菌检测方法， 属于病原体检测技术领 域， 该检测方法具体步骤如下： (1)微流控芯片设 计与制作； (2)监控整个病原菌检测过程； (3)病 原菌检测结果判断； 本发明通过利用相机等成像 设备或肉眼等即可对结果进行观察， 与LA MP进行 有机结合， 研发出兼顾上述两类技术优势的分子 诊断技术， 能够在POCT中简便、 快速、 灵活、 高通 量检测各种病原菌， 为临床诊治或感染事件现场 处置等情况节约时间和成本 。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 115521973 A 2022.12.27 CN 115521973 A 1.一种基于环介导等温扩增技术的病原菌检测方法， 其特征在于， 该检测方法具体步 骤如下： (1)微流控芯片设计与制作： 用电脑辅助设计软件按设计样式绘制芯片样式， 由喷蜡打 印机打印所需图案， 多层相同图案滤纸用不透水 的双面胶叠加， 形成亲水 的毛细通道和微 量反应池， 通过观察反应腔的颜色变化， 对检测结果进行判断； (2)监控整个病原菌检测过程： 1个阳性质控， 点样酵母DNA和相应引物， 监控整个实验 反应过程； 1个阴性质控， 未点样任何引物， 两种质控模式联合运用对每次测试的有效性进 行监控； (3)病原菌检测结果判断： 通过相机等成像设备或肉眼对微流控芯片进行结果观察， 在 检测过程中， 恒 温扩增反应体系中通过添加羟基萘酚蓝(Hydroxy  naphthol  blue， HNB)为 结果指示剂观察颜色变化， 由紫罗兰变为天蓝色为阳性， 无颜色变化 为阴性。 2.根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增技术的病原菌检测方法， 其特征在 于， 步骤(1)中所述微流控芯片设二个质控反应孔， 包括1个阳性质控， 点样酵母DNA和相应 引物； 1个阴性质控， 未点样任何引物， 同时将各种引物分别点样到相应的反应室。 3.根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增技术的病原菌检测方法， 其特征在 于， 步骤(2)中所述点样完成后， 室温下干燥1小时， 再将芯片用胶带密封， 保存在0 ‑4℃备 用， 使用时平衡到室温后进行加样。 4.根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增技术的病原菌检测方法， 其特征在 于， 步骤(3)中所述微流控芯片检测 仪主要由温度控制模块和 检测模块组成； 其中， 温度控 制模块为恒温扩增提供65℃的恒定温度， 检测模块使用肉 眼观察或成像设备进 行信号采集 判断结果。 5.根据权利要求4所述的一种基于环介导等温扩增技术的病原菌检测方法， 其特征在 于， 微流控芯片检测仪检测样品结果的判断如下： 反应腔颜色由紫罗兰变为天蓝色为阳性， 无颜色变化为阴性， 阳性质控检测结果应为 阳性； 阴性质控检测结果应为阴性， 表明本次检验结果有效； 若质控结果 错误， 则判定 本次检测结果无效。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115521973 A 2一种基于环 介导等温扩增技术的病原菌检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及病原体检测技术领域， 尤其涉及一种基于环介导等温扩增技术的病原 菌检测方法。 背景技术 [0002]传统的微生物培养法是病原体检测金标准， 需要耗时3 ‑5天， 涉及多种仪器和试 剂， 对人员的专 业技能和实验经验要求高， 因此， 缩短检验时间和减少实验条件限制一直备 受研究者的关注， 近年来， 利用分子生物学方法快速检测病原体获得了很大进展， 但检测需 要昂贵的核酸扩增仪， 对实验室和人员要求高， 程序复杂， 检测时间需要3 ‑5小时， 主要适用 于大型医疗机构和专业实验室， 环介导等温扩增技术， 针对靶基因的6个区域设计4 ‑6条特 异引物， 在恒定温度下， 利用链置换DNA聚合酶快速扩增目标基因的DNA或RNA， 通过观察添 加的指示物颜色变化或产生的荧光信号强度达到检测的目的， 检测过程只需要一个恒温 箱， 无需昂贵高精密的仪器， 目的基因就能大量、 高效地扩增， 该技术相比PCR技术来说， 运 行成本低， 检测时间短， 1小时内即可得到实验 结果， 而且LAMP对目的基因有高度选择性， 能 降低非靶序列的影响， 因此具有较高特异性， 降低了核酸检测的复杂度； 因此， 发明出一种 基于环介导 等温扩增技 术的病原菌检测方法变得 尤为重要； [0003]现有的基于环介导等温扩增技术的病原菌检测方法无法在POCT中简便、 快速、 灵 活、 高通量检测各种病原菌， 浪费时间以及提高成本； 为此， 我们提出一种基于环介导等温 扩增技术的病原菌检测方法。 发明内容 [0004]本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷， 而提出的一种基于环介导等温 扩增技术的病原菌检测方法。 [0005]为了实现上述目的， 本发明采用了如下技 术方案： [0006]一种基于环介导 等温扩增技 术的病原菌检测方法， 该检测方法具体步骤如下： [0007](1)微流控芯片设计与制作： 用电脑辅助设计软件按设计样式绘制芯片样式， 由喷 蜡打印机打印所需图案， 多层相同图案滤纸用不透水 的双面胶叠加， 形成亲水 的毛细通道 和微量反应池， 通过观察反应腔的颜色， 对检测结果进 行判断， 芯片制作后 将各种引物分别 点样到相应的反应室， 点样完成后， 室温下干燥1小时， 再将芯片用胶带密封备用； [0008](2)监控整个病原菌检测 过程： 1个阳性质控， 点样酵母DNA和相应引物， 监控整个 实验反应过程； 1个阴性质控， 未点样任何引物， 两种质控模式联合运用对每次测试的有效 性进行监控。 [0009](3)病原菌检测结果判断： 通过相机等成像设备或肉眼对微流控芯片进行结果观 察。 在检测过程中， 恒温扩增反应体系中通过添加羟基萘酚蓝(Hydroxy  naphthol  blue， HNB)为结果指示剂观察颜色变化， 由紫罗兰变为天蓝色为阳性， 无颜色变化 为阴性。 [0010]进一步地， 步骤(1)中所述微流控 芯片设二个质控反应孔， 包括1个阳性质控， 点样说　明　书 1/3 页 3 CN 115521973 A 3