65.020.20 CCS B 21 备案号： ICS 青 DB63 海 省 地 方 标 准 DB 63/ T XXXX —2021 青稞种子纯度 SNP 分子标记鉴定技术规程 点击此处添加标准英文译名 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 （报批稿） 2021 - XX - XX 发布 青海省市场监督管理局 2021 - XX - XX 实施 发 布 DB63/ T XXXX—XXXX 前 言 本文件按照GB/T 1.1─2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中国科学院西北高原生物研究所提出。 本文件由青海省农业农村厅归口。 本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省农作物种子站。 本文件主要起草人：沈裕虎、王寒冬、徐金青、王蕾、王焕强、包天忠、陈文杰、孔豆豆。 本文件由青海省农业农村厅监督实施。 I DB63/ T XXXX—XXXX 青稞种子纯度 SNP 分子标记鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了青稞种子纯度SNP分子标记鉴定相关术语和定义、仪器设备及试剂、溶液配制、KASP 引物信息、引物选择、操作程序、数据记录与统计、种子纯度计算等技术要求。 本文件适用于青稞品种（系）和种质资源种子纯度检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.3 转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T 30988 多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 推荐引物 种子纯度鉴定时优先选用的一套SNP引物。 4 仪器设备及试剂 本文件所使用的水均为一级水，符合GB/T 6682的要求。除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试 剂。见附录A。 5 溶液配制 见附录B。 6 KASP 引物信息 1 DB63/ T XXXX—XXXX 分为Ⅰ、Ⅱ两组。其他在本文件中未推荐的非连锁引物也可使用。见附录C。 7 KASP 引物选择 首先选择附录C中Ⅰ组引物进行扩增，当样品间检测出的差异位点数＜2 时，直接选用附录C中Ⅰ、 Ⅱ组所有引物进行扩增。 8 操作程序 8.1 样品准备 8.1.1 扦样 按照GB/T 3543.2的规定，各待检品种分别进行扦样、分样；每品种籽粒（种子）分为3份，一份用 于检测，一份留作复检，另一份用于备份。 8.1.2 发芽 按照GB/T 3543.4的规定进行发芽，发芽籽粒（种子）数需≥50个。 8.1.3 叶片采取 待植株长至三叶一心时，按单株采取真叶进行样品制备。 8.2 样品制备 8.2.1 DNA 提取 按照GB/T 19495.3的规定进行DNA的提取。按照GB/T 3543.5的规定，每各待检品种制备的DNA样品 数量需≥50个单株；单提、单检。 8.2.2 DNA 质量检测 按照GB/T 30988中的DNA纯度、浓度测试进行DNA质量检测。 8.3 实时荧光定量 PCR 仪 SNP 分型 SNP分型操作流程如下： 1) 将DNA样品编号后分别加到96孔PCR板上对应编号的反应孔中，每块PCR板均需加2个及以上的阴 性对照（NTC，即除由等量的超纯水替代DNA样品外，余所加试剂完全一致）。DNA样品尽量往 PCR板中部摆放，避免放在PCR板的四个角上，每块PCR板尽量只检测一个待检品种。 2) 依待检样品量按照表1，配制一定体积的KASP基因分型混合液。配制前所有试剂均应短暂地涡 旋振荡，补足损失的体积；引物原液稀释至10 μmol/L。 表1 KASP 基因分型混合液 试剂 体积（μL） 2×KASP Master mix 5 Primer_Allele [FAM] 0.5 Primer_Allele [HEX] 0.5 2 DB63/ T XXXX—XXXX 表 1 KASP 基因分型混合液（续） 试剂 体积（μL） Primer_Common 1 超纯水 1 总体积 8 3) 使用微量移液器将步骤2）中的KASP基因分型混合液分别加入到步骤1）已加入DNA样品的PCR 板上的反应孔中，每孔加8 μL。 4) 用荧光透视的膜将PCR板密封，然后离心（转速3000 rpm，时间30 sec）。 5) KASP反应在实时荧光定量PCR仪上进行，程序设置见表2。 表2 实时荧光定量 PCR 反应程序 步骤 说明 温度 时间 循环数 1 预变性 94℃ 15 min 1 变性 94℃ 20 sec 复性/延伸 61-55℃ 60 sec（每循环降低 0.6℃） 变性 94℃ 20 sec 复性/延伸 55℃ 60 sec 2 3 10 26 6) PCR反应结束后，在该仪器上进行荧光数据的读取，读取时程序设置为：温度30℃，时间60 sec， 循环数1。 7) 当数据对应的荧光信号较低，分群较散时，可以增加循环后进行荧光读取，同时保证NTC没有 被扩增。程序设置如下：94℃变性20 sec，57℃复性/延伸60 sec，此步骤进行3个循环。再按 照步骤6）进行荧光数据的读取。 9 数据记录与统计 样品每个SNP位点的等位变异采用荧光定量PCR仪检出的荧光信号表示，反应一致的记为N1，不一致 的记为N2；一致性品种也可参照附录D进行判定，根据送检样品在该位点的等位变异进行记录和计数统 计。 10 种子纯度计算 品种纯度（P）的数值以%表示（保留1位小数），按公式（1）计算： P  N1  100% ................................................................. (1) N1  N2 式中： P—品种纯度； N1—一致性品种种子数； N2—不一致性品种种子数。 3 DB63/ T XXXX—XXXX AA 附 录 A （资料性） 主要仪器设备及试剂 A.1 主要仪器设备 实时荧光定量PCR仪、电子恒温不锈钢水浴锅（0 ℃～100 ℃）、电子天平（精度0.01 g、0.0001 g 各一台）、磁力搅拌机、高速台式离心机、高通量组织研磨仪、微量分光光度计、高压灭菌锅、酸度计、 微量移液器（2.5 μl、10 μl、100 μl、1000 μl）、冰箱。 A.2 主要试剂 乙二胺四乙酸二纳、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、十六烷基三甲基溴化铵、β巯基乙醇、Tris-饱和酚、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、2×KASP Master mix、KBD Assay mix、超纯 水。 A.3 主要耗材 离心管（1.5 ml、2.0 ml）、微量移液器配套枪头（2.5 μl、10 μl、100 μl、1000 μl）、96孔 实时荧光定量PCR板、荧光透视的膜、一次性丁腈手套。 4 DB63/ T XXXX—XXXX BB 附 录 B （资料性） 溶液配制 B.1 DNA提取试剂 B.1.1 0.5 mol/L乙二胺四乙酸二纳盐（EDTA）（pH 8.0）溶液 称取9.305 g的EDTA-Na2·2H2O，加40 mL超纯水，混合均匀，用0.8 g～1.1 g NaOH颗粒调节pH至8.0， 定容至50 ml。在103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌20 min。 B.1.2 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris - HCl） （pH 8.0）溶液 称取6.06 g的Tris，加40 ml的超纯水，混合均匀。用1.8 mL～2.2 mL 的浓HCl（36 %～38 %）准确调 节pH至8.0，定容至50 ml。灭菌温度和时间同B.1.1。 B.1.3 DNA提取液 称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）8 g和氯化钠32.7 g，分别加入10 mL Tris - HCl溶液（pH 8.0） （见B.1.2）和4 mL EDTA溶液（pH 8.0）（见B.1.1），混合均匀，用超纯水定容至400 mL。灭菌温度和 时间同B.1.1，4 ℃保存。 B.1.4 70%乙醇 取70 mL无水乙醇，用超纯水定容至100 mL，混合均匀。 B.1.5 10倍DNA溶解液 取10 mL Tris - HCl溶液（pH 8.0）（见B.1.2）和2 mL EDTA溶液（pH 8.0）（见B.1.1），加入50 mL超纯水，混合均匀，定容至100 ml。灭菌温度和时间同B.1.1，室温保存。 5 DB63/ T XXXX—XXXX CC 附 录 C （资料性） 推荐 KASP 引物 推荐KASP引物见表C.1。 表C.1 推荐 KASP 引物 标记 引物组别 染色体 等位变异 KASP 引物序列（5′–3′） Primer_Allele [FAM]: CTGAGTTTGTGGAAGGAGCTATTTTT 1H_1 Ⅰ 1H A/T Primer_Allele [HEX]: CTGAGTTTGTGGAAGGAGCTATTTTA Primer_Common: TCAGTAAGAGTGAAATGACCTGCAACAAA Primer_Allele [FAM]: TGTTGCTCCTTCTGCTGCCC 2H_1 Ⅰ 2H C/A Primer_Allele [HEX]: GTTGTTGCTCCTTCTGCTGCCA Primer_Common: CCACACAAACCTCACTGCTAGTAGTA Primer_Allele [FAM]: CGCAACACCTGGATTCGGTCG 3H_1 Ⅰ 3H G/A Primer_Allele [HEX]: CGCAACACCTGGATTCGGTCA Primer_Common: CGCTGGCAGCTCCAGGGCAA Primer_Allele [FAM]: GCGTCAGGTTGAGGAGATTCTG 4H_1 Ⅰ 4H G/T Primer_Allele [HEX]: GGCGTCAGGTTGAGGAGATTCTT Primer_Common: AAGGTTGCCAAGCTCAAAAAGGAGAAATT Primer_Allele [FAM]: CGTCAGCACTGACTGTCCC 5H_