ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3278.1—2018 微生物农药 环境增殖试验准则 第1部分：土壤 Environmental reproduction test guidelinesfor microbial pesticides- Part 1:Soil 行业标准信息服务平台 2018-07-27发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3278.1—2018 前言 NY/T3278《微生物农药环境增殖试验准则》，分为3个部分： 第1部分：土壤； 一第2部分：水； 一第3部分：植物叶面。 本部分为NY/T3278的第1部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业农村部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。 本部分主要起草人：卜元卿、周欣欣、单正军、朱昱璇、袁善奎、姜辉、张燕宁、张兰。 行业标准信息服务平台 1 NY/T3278.1—2018 微生物农药 环境增殖试验准则 第1部分：土壤 1范围 本部分规定了微生物农药在土壤中增殖试 件、试验操作、数据处理、质量控制、试验报 告等的基本要求。 寿 AT 2 规范性引用文件 下列文件对于 件的应用 少的。 凡是注日期的 用文 仅日 期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用及件 其最新版包括所有的修改单适用于本 GB7172 水分测定 上壤 GB15618 士 量标准 RA 3 术语和定义 下列术语和定 义适用 3. 1 微生物农药 micrdbial pesticide 以细菌、真 病莓和 菌 动物或车 修饰的微生生 鼠等有害生物作用 3. 2 R 供试物 test 3.3 菌落形成单位 colony forming uis C 殖所形成 3.4 细菌芽孢 bacterial spore 某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休 眠体。 3.5 真菌孢子fungal spore 真菌的主要繁殖器官。分为有性孢子和无性孢子两大类。孢子在适宜条件下发芽，形成菌丝而进 行分裂繁殖；当外界环境不适宜时，可以呈休眠状态长时间生存。 3.6 细菌孢囊 bacterial cyst 某些细菌尤其是一些固氮菌在外界缺乏营养的条件下，由整个营养细胞外壁加厚、细胞失水而形成 的一种抗干旱但不抗热的圆形休眠体。 1 NY/T3278.1—2018 3. 7 原生动物孢囊protozoancyst 某些原生动物在外界环境不利条件下，形成的能高度抵抗干旱、冰冻和高温的休眠体。 3.8 细菌营养体vegetativebacterium 单个活的生物体，通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。 3.9 原生动物protozoa 最原始、最低等的单细胞动物。原生动物除了具有真核细胞的一般特征（具细胞膜、细胞核和细胞 质等）外，其细胞本身是一独立完整的有机体，通过细胞内和细胞表面的一些特殊细胞器来完成运动、营 养和生殖等生命活动。 3.10 宿存survival 具有活性的微生物在施用后的一段时间内可在动物、土壤或植物内体或表面保持活性的状态。 3.11 增殖multiplication 微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生 命个体数量增加的生物学过程。 3.12 延滞期lagphase 少量微生物接种到新鲜培养基后，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，微生 物数目没有增加的一段时期。 3.13 指数期logphase 在生长曲线中，紧接着延滞期的一段微生物数量以几何级增长的时期。 3. 14 稳定期stationaryphase 新增殖的微生物数量与衰亡的微生物数量相等的时期，这个时期的菌体数量达到最高。 3.15 衰亡期deathphase 微生物的个体死亡速度超过新增殖速度，整个群体呈现负生长状态的时期。 4试验概述 将供试物接种到无菌土壤中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其数量，得到供试物在土壤中的 动态变化。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1试验用土 推荐黑土作为试验用土，或采用供试物拟施用地区土壤作为试验用土，试验用土满足GB15618二 级标准的要求。取土壤表面以下0cm～20cm的新鲜土样，封口带回实验室，除去粗大枝叶、动物躯壳 等，风干保藏。风干土壤含水量测定按照GB7172的规定执行。风干土壤研磨过0.42mm筛，用自来 2 NY/T3278.1—2018 水调节土壤含水量为最大田间持水量的40%~60%。然后每份100g分装入500mL锥形瓶，至少8 份，121℃灭菌25min~30min。 5.1.2供试物 5.1.2.1类型 供试物包括微生物农药母药、制剂产品。 5.1.2.2批次 试验中供试物应采用同一批次的产品 5.1.3主要仪器设备 超净工作台。 灭菌锅。 显微镜。 分光光度计。 荧光定量PCR仪 温度计。 天平。 5.2试验操作 5.2.1处理组和对 5.2.1.1处理组 设置供试 5. 2. 1. 2 对照组 工 设置培养 白对照 置4个 重复 5.2.2接种量 C 接种浓度为 不能达到 CFUIm 可以根据推荐 验用 N 使用量计算菌株 nL的菌液。 浓度 接种卡 100 mL浓度 5.2.3接种与培养 在超净工作台内 菌水配制好的供试物接 人火闲 土壤充分混合均 匀，封口膜封口后放入培 养箱培养 试物按照其最佳生长条件设立培 养温具 显度、氧气、光照等培养 参数。 5.2.4取样与存放 自接菌后第1d开始取样，前4d每天取样，取样前搅拌均匀，每次取 4组样品各1.0g，进行计数测 试。4d后，每隔1d取一次样品。每次取样前先称重，用当工重量与上次取样后质量差量为失水量，无 菌水补充失水量。试验期间，维持土壤含水量为最大田间水量的40%～60%。取样量和取样间隔时 间可根据供试物的生长情况调整。样品4℃保存。 5.2.5计数方法 5.2.5.1细菌、放线菌、真菌、酵母 以CFU为计数单位，可采用稀释平板菌落计数法（参见附录A）、绿色荧光蛋白基因标记-平板计数 法（参见附录B）测定。 以基因拷贝数为计数单位，可采用分子标记-荧光定量PCR法（参见附录C）测定。 5.2.5.2原生动物、真菌孢子、酵母 以个体数目为计数单位，可采用直接计数法（参见附录D)等测定。 5.2.6试验周期 NY/T3278.1—2018 试验持续时间应能够反映供试物的延滞期、指数期、稳定期和衰亡期；或在28d内持续检测确认供 试物含量维持稳定或显著低于接种量，则可结束试验。 5.2.7生长-消亡曲线 以培养时间为横坐标、以供试物含量的对数为纵坐标做图，绘出供试物的生长-消亡曲线。 5.3数据处理 5.3.1独立样本t检验 2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式（1)计算。 X, -X2 .(1) + V n-1 式中： Xi,X2 分别为两样本平均数； 分别为两样本方差； 样本容量。 n 5.3.2单因子方差分析（One-WayANOVA) 3组及以上均值比较时可进行方差分析。单因子方差分析LSD检验按式（2)计算。 LSD=ta(df,)S,, （2) 式中： ta(df) 在F检验中误差自由度下，显著水平为α的临界t值； Sa 均数差异标准误，按式（3）计算。 S寸-号=V2MS./n (3) 式中： MS. F检验中误差均方； n 各处理重复数。 5.4质量控制 第Od时灭菌土壤不得检出微生物活菌。 使用荧光定量PCR法计数微生物数量时，扩增效率的范围应为90%~110%。 6试验报告 试验报告应至少包括下列内容： 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号； a b) 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况； 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期； 供试物基本信息（如含量和组成信息，以及任何改变供试物生物活性物质的含量和组成信息、 施用量、施用方法等）； 试验系统的详细描述； e) 试验条件，包括试验土壤含水量、pH、有机质含量、温度、光照等； f) 试验结果，绘制供试物的生长-消亡曲线。 g) 4 NY/T 3278.1—2018 附录A （资料性附录） 稀释平板菌落计数法 A.1方法原理 由单个细胞生长并繁殖成一个菌 A.2试剂 A.2.1 蛋白陈 A.2.2牛肉膏 A.2.3 可溶性 定粉 URAL A. 2. 4 酵母膏 A.2.5 麦芽汉 A. 2. 6 葡萄糖 A. 2.7 硝酸锌 A.2. 8 氯化销 A.2.9 磷酸 A. 2. 10 磷酸氢 A. 2. 11 七水硫 A.2. 12 七水硫酸 A. 2. 13 吐温80。 A. 2. 14 孟加拉红。 A. 2. 15 氯霉素。 A.2. 16 氢氧化钠溶液：1mol A.2. 17 盐酸溶液：1mol/L。 A.2. 18 息服务平台 琼脂。 注：以上化学试剂均为分析纯。 A.3仪器设备 A.3.1高压蒸汽灭菌锅。 A.3.2恒温培养箱。 A. 3.3 超净工作台。 A.3.4酸度计等。 5