ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3279.1—2018 病毒微生物农药 首银纹夜蛾核型 多角体病毒 第1部分：首银纹夜蛾 核型多角体病毒母药 Viral-based insecticides-Autographa californica nucleopolyhedrovirus(AcNPV)- Part 1 :Autographa californica nucleopolyhedrovirus technical concentrate(TK) 行业标准信息服务平台 2018-07-27发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3279.1—2018 前言 NY/T3279《病毒微生物农药首银纹夜蛾核型多角体病毒》分为2个部分： 第1部分：首银纹夜蛾核型多角体病毒母药； 一第2部分：首银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂。 本部分为NY/T3279的第1部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业农村部农药检定所、中国科学院动物研究所、河南省济源白云实业有限公司。 本部分主要起草人：秦启联、杨峻、张寰、王晓军、方分分、张继红、郭明程。 行业标准信息服务平台 I NY/T3279.1—2018 病毒微生物农药 首银纹夜蛾核型多角体病毒 第1部分：首银纹夜蛾核型多角体病毒母药 1范围 本部分规定了首银纹夜蛾核型多角体病毒母药的要求、试验方法，产品的检验与验收以及标志、 标签、包装、储运、安全和保质期 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必 环可 期的版本适用于本文 的引用文代其最新版本 件。凡是不注日期的 有的修改单） GB/T 1601 农药 pH值的测定方法 商品农约验收规则 GB/T 1604 GB/T1605 商品农药采样方法 包装通贝 GB3796 衣药 品全 GB4789.2 国家标准食品微生物 GB6682 实验 规格和试验方 GB/T 817 教值修 GB/T 161 1995 药粉剂可湿 GB20813 药产品 3术语和定义 下列术语和定义用本 3. 1 rus(AcNPV)techni- cal concentrate(TK) 以病毒包涵体为主要成分，有效含量为 银纹夜蛾核型多角体病毒，通常情况还会包含伴随病毒 扩增而产生的宿主昆虫或细胞的生物组分。 3.2 病毒包涵体polyhedralinclusionbody(PIB） 病毒水平传播的主要载体形式，其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的多角体中 3. 3 生测效价比potencyratio 根据药物的药理和对生物体的作用设计试验，比较样品、标准品引起的生物反应，测定药物效价或 其生物学活性。 3. 4 菌落形成单位colonyformingunits(CFU) 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。指在琼脂平板上经过 一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。 1 NY/T3279.1—2018 3.5 杂菌菌落总数numberofmicrobialcontaminants 将首银纹夜蛾核型多角体病毒母药样品稀释后涂布在琼脂营养培养基上，所得到的微生物（真菌 和细菌)菌落数之和。 4要求 4.1外观 通常为灰白色或褐色均匀粉状物，无可见机械杂质，不应有结块。或者灰白色或褐色液体，存放过 程中可能出现沉淀，经搅动能恢复原状，不应有结块。 4.2指标 首银纹夜蛾核型多角体病毒母药还应符合表1的要求。 表1首银纹夜蛾核型多角体病毒母药控制项目指标 指标 病毒包涵体数量，PIB/g或PIB/mL ≥100亿 生测效价比（标准品LCso/待测样品LCso），% ≥80.0 杂菌菌落总数，CFU/mL ≤1.0X107 pH 5.0~7.5 （固体）干燥减量，% 细度（通过75μm标准筛），% ≥95.0 5试验方法 5.1一般规定 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液，试验用水为GB/T6682中规定 的三级水。 5.2抽样 按照GB/T1605中”固体制剂采样”“液体制剂采样”方法进行。用随机数表法确定抽样的包装件， 最终抽样量应不少于200g（mL） 5.3毒种定性鉴别 5.3.1病毒毒种的分子鉴定 首银纹夜蛾核型多角体病毒毒种的鉴定，采用PCR扩增及DNA测序分子鉴定的方法。通过提 取试样中病毒DNA作为模板，用AcNPV的ie-1基因、helicase基因和gp64基因的特异性引物分别 进行PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳检测。当PCR扩增片段大小约为1kb或300bp时，回收扩增片 段，并克隆到T载体上，用M13通用引物对克隆后的PCR产物进行测序，将测序结果分别与AcNPV （E2株）的ie-1基因、helicase基因及gp64基因进行比对分析，两者的序列一致性均应该大于98%，即 认定试样中含有首银纹夜蛾核型多角体病毒。 首银纹夜蛾核型多角体病毒有效成分描述参见附录A。首银纹夜蛾核型多角体病毒毒种的分 子鉴定方法按照附录B的规定。 5.3.2病毒毒种的生物测定鉴别 生物测定的方法作为首银纹夜蛾核型多角体病毒毒种分子鉴定的补充。分别对粉纹夜蛾、甜菜 夜蛾和家蚕3种昆虫幼虫进行生物测定。粉纹夜蛾和甜菜夜蛾感病症状：虫体体色粉白，体节膨大，行 动缓慢，甚至液化而亡，其感病特征非常明显。而家蚕的校正死亡率应小于20%，依此可以确定试样中 2 NY/T3279.1—2018 的病毒为首银纹夜蛾核型多角体病毒。 病毒毒种生物测定鉴别的方法参见附录C。 5.4病毒包涵体的定量检测 5.4.1血球计数板法 5.4.1.1方法提要 称取少量的病毒试样，用定量的蒸馏水稀释成水悬浮液，并稀释至适当倍数后，滴加在血球计数板 上，在光学显微镜下计数。根据血球计数板上病毒包涵体的数量以及稀释倍数，计算出单位质量（体积） 病毒的数量。 5.4.1.2仪器、设备 分析天平，精确至0.0001 光学显微镜。 血球计数板。 微量移液器，1μ L 容量瓶，100mL RE 5.4.1.3测定步骤 5.4.1.3.1将试样充 分报物搭 习后，准确称取或吸取试样适量（精确到0.000 1置 100mL容量 瓶中，加水稀释至刻度， ，制备母 液。取母液稀释成适当浓度的悬浮液（约4×16 2A 个病毒包涵体十数时 将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用 终稀释液使每小格有 的盖玻片，用微量移液器吸取稀释后的病毒悬液，滴 次性充满计 盖 数室，防止产生 气泡 液的量不超过计数室台面与 盖玻片之间的矩形边缘 C 5.4.1.3.2将载有 #包涵体全部沉限 到计数室底部后，放在 数池 涵体的总数。2个计 显微镜下观察2个 料 和取 C 数池各5个中方 5.4.1.4计算 C 首银纹夜蛾核 多角体病 R 80 式中： Xi 首银纹夜蛾核型多角体病毒包滴体 单位为PB每克 PIB/g）或PIB每毫升 含量 (PIB/mL) A 2个计数池各5个中方格中病每涵体总数的平均值，单位为PIB； B ） -1mL母液含有的计数小方格的个数，单个每笔升（个/mL）； 4X106 80 计数小方格的个数，单位为个。 5.4.1.5允许误差 病毒包涵体含量2次平行测定结果之差，应不大于20%，取其算术平均值作为测定结果， 5.4.2生测效价比的测定 病毒试样用蒸馏水制成待测的病毒悬浮液，均匀涂布在人工饲料上，晾干后饲喂甜菜夜蛾幼虫，重 复3次。试验过程中供试昆虫采取单头饲养方式，环境温度控制在（26士1)℃，湿度40%以上。统计第 3d～第7d幼虫的死亡情况，计算其校正死亡率 仪器设备、试剂材料、测定步骤等具体按照附录D的规定执行。 5.5杂菌菌落总数的测定 3 NY/T3279.1—2018 按GB4789.2的规定执行。 5.6pH的测定 按GB/T1601的规定执行。 5.7干燥减量的测定 5.7.1方法提要 按干燥减量法测定，即试样经加热后，计算失去的水分占称取试样质量的百分比。 5.7.2仪器、设备 分析天平，精确至0.001g。 电热恒温干燥箱，控温范围50℃~200℃，误差士2℃。 扁形称量瓶，直径40mm。 干燥器。 5.7.3试验步骤 将称量瓶在（105士2)℃电热恒温干燥箱内烘至恒重（精确至0.001g）。称取试样10.0g（精确至 0.001g）置于预先称重的称量瓶内，放人（105土2）℃电热恒温干燥箱内干燥，1h后取出，在干燥器中冷 却至室温，称重。 5.7.4测定结果 干燥减量X²按式(2)计算。 (2) m 式中： X2- 干燥减量，单位为百分率（%）； 试样的质量，单位为克（g)； m 干燥试样的质量，单位为克（g）。 mi 5.7.5允许误差 2次平行测定结果之差，应不大于0.5%，取其算术平均值作为测定结果。 5.8细度的测定 按GB/T16150--1995中2.2的规定执行。 6产品的检验与验收 应符合GB/T1604的规定。极限数值处理采用GB/T8170中的修约值比较法。 7标志、标签、包装、储运、安全和保质期 7.1标志、标签 7.2包装 应符合GB3796和GB20813中的有关规定。 7.3储运 首银纹夜蛾核型多角体病毒母药包装件，应在10℃以下的避光环境中储运。 储运过程中应有遮 避装置，严防日晒和潮湿。 7.4安全 在使用说明书或包装标签上，除有相应的毒性标志外，还应有毒性说明、中毒症状、解毒方法和急救 措施。 4 NY/T 3279.1—2018 7.5保质期 在