ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3279.2—2018 病毒微生物农药 首银纹夜蛾核型 多角体病毒 第2部分：首银纹夜蛾核型 多角体病毒悬浮剂 Viral based insecticides-Autographa californica nucleopolyhedrovirus(AcNPV)- Part 2:Autographa californica nucleopolyhedrovirus suspension concentrate(SC) 行业标准信息服务平台 2018-07-27发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3279.2—2018 前言 NY/T3279《病毒微生物农药首银纹夜蛾核型多角体病毒》分为2个部分： 第1部分：首银纹夜蛾核型多角体病毒母药； 第2部分：首银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂。 本部分为NY/T3279的第2部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业农村部农药检定所、中国科学院动物研究所、河南省济源白云实业有限公司。 本部分主要起草人：秦启联、王晓军、张寰、郭明程、王红托、程清泉、何静。 行业标准信息服务平台 NY/T3279.2—2018 病毒微生物农药 首银纹夜蛾核型多角体病毒 第2部分：首银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂 1范围 本部分规定了首银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂的要求、试验方法、产品的检验与验收以及标 志、标签、包装、储运、安全和保质期 核型多角体病毒悬浮剂 规范性引用文件 2 下列文件对于 必不 的 凡是注日期的 的版本适用于本文 用女件 有的修改单适用于本 件。凡是不注日期的可 其最新版 包括所 GB/T160 GB/T160 商品农药 验收规则 商品衣车 采样方法 GB/T1605 GB3796 药包装通 农 则 食品字 GB4789. 家标准食品微 落总数测处 GB6682 折实验 介 数值修 GB/T8170 GB/T14825 农药 GB/T1615 1995 药粉剂 GB 20813 GB/T28137 GB/T31737 倾倒性测 3术语和定义 下列术语和定义适用于 3. 1 首银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂 Autographacaliformicanucleopolyhedrovirus(AcNPV)sus- pension concentrate(SC) 以首银纹夜蛾核型多角体病毒母药与适宜的载体及分散剂混合均匀的液体制剂。 3. 2 病毒包涵体 polyhedralinclusionbody(PIB) 病毒水平传播的主要载体形式，其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的多角体中 3.3 生测效价比potencyratio 根据药物的药理和对生物体的作用设计试验，比较样品、标准品引起的生物反应，测定药物效价或 其生物学活性。 3. 4 1 NY/T3279.2—2018 菌落形成单位colonyformingunits(CFU) 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。指在琼脂平板上经过 一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。 3.5 杂菌菌落总数numberofmicrobialcontaminants 将首银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂样品稀释后涂布在琼脂营养培养基上，所得到的微生物（真 菌和细菌）菌落数之和。 4要求 4.1外观 应是可流动、易测量体积的悬浮液体；存放过程中可能出现沉淀，摇匀应恢复原状，不应有结块。 4.2指标 首银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂还应符合表1的要求。 表1首银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂控制项目指标 项 目 指标 标示值 病毒包涵体数量，PIB/mL 生测效价比（标准品LCso/待测样品LCso），% >80.0 ≤1.0X107 杂菌菌落总数，CFU/mL pH 5.0~7.5 悬浮率，% >80.0 细度（通过75μm标准筛），% >95.0 倾倒后残余物，% ≤3.0 倾倒性 洗涤后残余物，% <0.5 持久起泡量（1min后），mL ≤30.0 5试验方法 5.1一般规定 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液，试验用水为GB/T6682中规定 的三级水。 5.2抽样 按照GB/T1605中“液体制剂采样”方法进行。用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量应不 少于200mL。 5.3毒种鉴别 5.3.1病毒毒种的分子鉴定 首猎银纹夜蛾核型多角体病毒毒种的鉴定，采用PCR扩增及DNA测序分子鉴定的方法。通过提 取试样中病毒DNA作为模板，用AcNPV的ie-1基因、helicase基因和gp64基因的特异性引物分别 进行PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳检测。当PCR扩增片段大小约为1kb或300bp时，回收扩增片 段，并克隆到T载体上，用M13通用引物对克隆后的PCR产物进行测序，将测序结果分别与AcNPV （E2株）的ie-1基因、helicase基因及gp64基因进行比对分析，两者序列一致性均应该大于98%，即认 定试样中含有首银纹夜蛾核型多角体病毒。 首猎银纹夜蛾核型多角体病毒有效成分描述参见附录A。首银纹夜蛾核型多角体病毒毒种的分 子鉴定方法按照附录B的规定。 5.3.2病毒毒种的生物测定鉴别 NY/T3279.2—2018 生物测定的方法作为首银纹夜蛾核型多角体病毒毒种分子鉴定的补充。分别对粉纹夜蛾、甜菜 夜蛾和家蚕3种昆虫幼虫进行生物测定。粉纹夜蛾和甜菜夜蛾感病症状：虫体体色粉白，体节膨大，行 动缓慢，甚至液化而亡，其感病特征非常明显。而家蚕的校正死亡率应小于20%，依此可以确定试样中 的病毒为首银纹夜蛾核型多角体病毒。 病毒毒种生物测定鉴别的方法参见附录C。 5.4病毒包涵体的定量检测 5.4.1血球计数板法 5.4.1.1方法提要 称取少量的病毒试样，用定量的蒸留水稀释成水悬浮液，并稀释至适当倍数后，滴加在血球计数板 ，计算出单位质量（体积） 病毒的数量。 5.4.1.2仪器、设备 分析天平，精确至 光学显微镜。 血球计数板 微量移液器 容量瓶，100 ml 5.4.1.3测定 A 5.4.1.3.1将试样 荡摇匀后，准确吸取试 加火希释至 美充分派 刻度，制备 F100mL 容量瓶 母液。取母液稀释 成适当 PIB mL）用于计数（最终稀释 夜使每小 小格有2个～4 数时 个病毒包涵体） 板的计 赶加盖专用的盖玻片， 稀释后的病毒悬液 滴于盖 性充满计数 方正产生 泡，充人悬 台面 C 液的量不超过计数 5.4.1.3.2将载有 薄包涵 底部后，放在 室 显微镜下观察2个计数池，每 包涵体的总数。2个计 角及正中央 中方格， 数池各5个中方格之取共平 5.4.1.4计算 首银纹夜蛾核型 体病毒 .(1) 式中： 首银纹夜蛾核型多角体病毒包涵体含位 立为PIB每毫升（PIB/mL）； A -2个计数池各5个中方格中病毒包涵体总数的平均值，单位为PIB； B 样品稀释倍数，单位为毫升每毫升（mL/mL）； 4X106 -1毫升母液含有计数小方格的个数，单位为个每毫升（个/mL）； 80 计数小方格数，单位为个。 5.4.1.5允许误差 病毒包涵体含量2次平行测定结果之差，应不大于20%，取其算术平均值作为测定结果。 5.4.2生测效价比的测定 病毒试样用蒸馏水制成待测的病毒悬浮液，均匀涂布在人工饲料上，晾干后饲喂甜菜夜蛾幼虫，重 复3次。试验过程中供试昆虫采取单头饲养方式，环境温度控制在（26士1)℃，湿度40%以上。统计第 3 NY/T3279.2—2018 3d～第7d幼虫的死亡情况，计算其校正死亡率。 仪器设备、试剂材料、测定步骤等具体按照附录D的规定执行。 5.5杂菌菌落总数的测定 按GB4789.2的规定执行。 5.6pH的测定 按GB/T1601的规定执行。 5.7细度的测定 按GB/T16150—1995中2.2的规定执行。 5.8倾倒性试验 按GB/T31737的规定测定。 5.9悬浮率的测定 称取1.00g试样（精确至0.0001g，悬浮剂）。按GB/T14825的规定执行。按5.4规定的方法测 定试样和剩余的1/10悬浮液中的首银纹夜蛾核型多角体病毒量，计算其悬浮率。 5.10持久起泡量试验 悬浮剂类产品，按GB/T28137的规定测定。 6产品的检验与验收 应符合GB/T1604的规定。极限数值处理采用GB/T8170中的修约值比较法。 7标志、标签、包装、储运、安全和保质期 7.1标志、标签 7.2包装 应符合GB3796和GB20813中的有关规定。 7.3储运 储运过程中应有遮避装置，严防日晒和潮湿。 7.4安全 在使用说明书或包装标签上，除有相应的毒性标志外，还应有毒性说明、中毒症状、解毒方法和急救 措施。 7.5保质期 在规定储运条件下，首银纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂的质量保证期从生产日期算起为2年。2 年保质期内，生测效价比和病毒包涵体数量不低于4.2中的指标， 服务平台 4 NY/T3279.2—2018 附录A （资料性附录） 首银纹夜蛾核型多角体病毒有效成分描述 A.1 中文通用名称 首银纹夜蛾核型多角体病毒。 A.2拉丁文学名 Autographa cali orn te A. 3 生物学分类 杆状病毒科 Alpha 毒属 A.4生物学特性 A.4.1形态结构 粒为杆状 多个杆状 核衣壳中含 被包藏在蛋百晶体内形成包涵体，在NPV中称为多 有病毒基因组 显微镜下 观察