ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3281.1—2018 病毒微生物农药 小菜蛾颗粒体病毒 第1部分：小菜蛾颗粒体病毒悬浮剂 Viral based insecticides-Plutella xylostella granulovirus(PlxyGV)- Part 1:Plutella xylostella granulovirus suspension concentrate(SC) 行业标准信息服务平台 2018-07-27发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3281.1—2018 前 NY/T3281《病毒微生物农药小菜蛾颗粒体病毒》拟分为如下部分： 第1部分：小菜蛾颗粒体病毒悬浮剂； ........... 本部分为NY/T3281的第1部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业农村部农药检定所、中国科学院动物研究所、河南省济源白云实业有限公司。 本部分主要起草人：张寰、王晓军、方分分、陈立萍、王红托、秦启联、郭明程。 行业标准信息服务平台 NY/T 3281.1—2018 病毒微生物农药 小菜蛾颗粒体病毒 第1部分：小菜蛾颗粒体病毒悬浮剂 1范围 本部分规定了小菜蛾颗粒体病毒悬浮剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、储运、安全和保质期。 本部分适用于以小菜蛾颗粒体病毒包涵体为主要成分的母药添加适宜助剂加工而成的颗粒体病毒 悬浮剂。 2规范性引用文件 文件 的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件共最新版本 H值的测定方法 GB/T 1601 GB/T 1604 农药验收规则 商品 GB/T1605 商品农药采 样方法 农药包装通则 GB3796 安全国 GB 4789.2 食品 家标准 蒸总数测 GB6682 分析 验室月 值修约 GB/T 8170 药悬浮 GB/T14825 95衣 GB/T16150 GB 20813 农 品标签达 药 GB/T28137 GB/T31737 3术语和定义 下列术语和定义适用于本 3.1 小菜蛾颗粒体病毒悬浮剂 plutellaxylostellagranulovirus(PlxyGy uspensionconcentrate(SC) 以小菜蛾颗粒体病毒母药与适宜的载体及分散剂混合均勾的 体制剂。 3.2 病毒包涵体 occlusionbody(OB) 病毒水平传播的主要载体形式，其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的包涵体中。 3.3 生测效价比potencyratio 根据药物的药理和对生物体的作用设计试验，比较样品、标准品引起的生物反应，测定药物效价或 其生物学活性。 3. 4 菌落形成单位 colonyformingunits(CFU) 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。指在琼脂平板上经过 1 NY/T 3281.1—2018 一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。 3.5 杂菌菌落总数 numberofmicrobialcontaminants 将小菜蛾颗粒体病毒悬浮剂样品稀释后涂布在琼脂营养培养基上，所得到的微生物（真菌和细菌） 菌落数之和。 4要求 4.1外观 应是可流动、易测量体积的悬浮液体；存放过程中可能出现沉淀，摇匀应恢复原状，不应有结块。 4.2指标 小菜蛾颗粒体病毒悬浮剂还应符合表1的要求。 表1小菜蛾颗粒体病毒悬浮剂控制项目指标 项 指标 病毒包涵体数量，OB/mL ≥标示值 生测效价比（标准品LCso/待测样品LC5o），% ≥80.0 杂菌菌落总数，CFU/mL ≤1.0×107 pH 5.0~7.5 悬浮率，% ≥80.0 细度（通过75μm标准筛），% ≥95.0 倾倒后残余物，% ≤3.0 倾倒性 洗涤后残余物，% <0.5 持久起泡量（1min后），mL <30.0 5试验方法 5.1 一般规定 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液，试验用水为GB/T6682中规定 的三级水。 5.2抽样 按照GB/T1605中“液体制剂采样”方法进行。用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量应不 少于200mL。 5.3毒种鉴别 毒种鉴别使用显微镜镜检与生物测定相结合的方法。通过显微镜镜检的方法确定试样病毒为颗粒 体类病毒。取试样适量，用蒸馏水制成浓度大于2×10?OB/mL的病毒悬浮液，在显微镜下物镜使用油 镜（放大100倍）观察，显示有很多小颗粒作布朗运动（无规则热运动），验证该病毒为颗粒体类病毒 通过生物测定的方法确定试样为小菜蛾颗粒体病毒。依次测试小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾3种幼 虫。取上述病毒悬浮液，均匀涂布在人工饲料上，晾干后饲喂2龄小菜蛾幼虫或者棉铃虫、甜菜夜蛾幼 虫，并设置蒸馏水对照，重复3次。每处理用虫90头（30头×3），环境温度控制在（26王1）℃、湿度40% 以上。试验后第2d开始观察小菜蛾的死亡情况，统计至第7d，计算其校正死亡率。小菜蛾幼虫感病症 状：虫体体色乳白，体节膨大，行动缓慢，其感病特征非常明显。小菜蛾校正死亡率应达到80%以上，而 棉铃虫、甜菜夜蛾的校正死亡率小于20%。依此可以确定上述病毒为小菜蛾颗粒体病毒。 小菜蛾颗粒体病毒有效成分描述参见附录A。仪器设备、试剂材料、测定步骤等按照附录B的规定 执行。 5.4定量检测 2 NY/T3281.1—2018 5.4.1细菌计数板法 5.4.1.1方法提要 小菜蛾颗粒体病毒包涵体的含量采用细菌计数板计数法测定。取试样适量，用0.1%SDS稀释适 当倍数，获得悬浮液，滴加在细菌计数板上在光学显微镜下计数。根据细菌计数板上病毒包涵体的数量 以及稀释倍数，计算出单位质量（体积）病毒的数量。 5.4.1.2仪器、设备 光学显微镜（物镜具备油镜镜头）。 细菌计数板。 微量移液器：1uL~1mL。 容量瓶：100mL。 5.4.1.3测定步骤 RD mL容量瓶中，加0.1% SDS稀释至刻度，制备 母液使用 SDS稀释成适当 的悬浮液（浓度约为2×107OB/ 母液 mL）用于计数（最终稀释液使每小格有2 个病毒包涵体）。 将清液于燥的细菌计数板的 计数室上加盖专用的 玻片用微量移液器吸取稀释后的病毒悬液滴于盖玻 边缘让悬液自行缓缓渗 盖 防山产 人，一次性充满计数室并 生气泡，充人息液的量 彩边缘。 5.4.1.3.2将载有试 式样溶液的计数板静20m，待病毒包酒体全部沉降到计数室底部后， 放在显微 镜下观察2个计数池 个中方格，十数病毒包涵体的点数 个计数池 RCH 各5个中方格之和取 值即为计数结果。 5.4.1.4计算 J 小菜蛾颗粒体病 毒包涵体含量X（单位为OB/ml）按式Q LCENT ...(1) 式中： 小菜蛾果 ，单位为OB每 升COB A 2个 池5 位为 B 样品稀释 ml 1mL含有的病包涵体的个数，单位为个每毫升 2X107 80 计数小方格数， 单位为个 5.4.1.5允许误差 病毒包涵体含量2次平行测定结果之差应不大于20%，取其算术平均值作为测定结果。 5.4.2荧光定量PCR法 包涵体数目。荧光定量PCR分析法，是通过已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。本 方法根据小菜蛾颗粒体病毒基因组的单拷贝基因中保守区域设计引物，构建含有目的基因质粒作为标 准品，绘制标准曲线。通过荧光定量PCR的方法获得上述单拷贝基因的拷贝数，通过计算获得基因组 的拷贝数，进而推算出颗粒体病毒包涵体的数目。 仪器设备、试剂材料、测定步骤等具体参照附录C的规定执行。 5.4.3生测效价比的测定 病毒试样使用蒸馏水稀释，获得特定浓度的待测病毒悬浮液，均匀涂布在人工饲料上，晾干后饲喂 小菜蛾、棉铃虫和甜菜夜蛾幼虫，重复3次。环境温度控制在（26士1)℃、湿度40%以上。统计2d～7d 幼虫的死亡情况，计算校正死亡率 3 NY/T3281.1—2018 仪器设备、试剂材料、测定步骤等具体按照附录D的规定执行。 5.5杂菌菌落总数的测定 按GB4789.2的规定执行。 5.6PH的测定 按GB/T1601的规定执行。 5.7细度的测定 按GB/T16150—1995中2.2的规定执行。 5.8倾倒性试验 按GB/T31737的规定测定。 5.9悬浮率的测定 按GB/T14825的规定执行。按5.4规定方法测定试样和剩余的1/10悬浮液中的小菜蛾颗粒体 病毒量，计算其悬浮率。 5.10持久起泡量试验 按GB/T28137的规定测定。 6产品的检验与验收 应符合GB/T1604的规定。极限数值处理采用GB/T8170中的修约值比较法。 7标志、标签、包装、储运、安全和保质期 7.1标志、标签 应符合GB3796和GB20813的规定，注明“低毒”“防曝晒”“防高温”等标志。 7.2包装 应符合GB3796和GB20813中的有关规定 7.3储运 储运过程中应有遮避装置，严防日晒和潮湿。 7.4安全 在使用说明书或包装标签上，除有相应的毒性标志外，还应有毒性说明、中毒症状、解毒方法和急救 措施。 7.5保质期 在规定储运条件下，小菜蛾颗粒体病毒悬浮剂的质量保证期从生产日期算起为2年。2年保质期 信息服务平台 内，生测效价比和病毒包涵体数量不低于4.2指标。 4 NY/T 3281.1—2018 附录A 资料性附录） 小菜蛾颗粒体病毒有效成分描述 A.1中文通用名称 小菜蛾颗粒体病毒。 A.2 拉丁文学名 Plutella ylostella PIxyGV