ICS65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3282.1—2018 真菌微生物农药 金龟子绿僵菌 第1部分：金龟子绿僵菌母药 Fungalpesticides-Metarhizium anisopliae- Part 1: Metarhizium anisopliae technical concentrate (TK) 行业标准信息服务平台 2018-07-27发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3282.1—2018 前言 NY/T3282《真菌微生物农药金龟子绿僵菌》分为3个部分： 第1部分：金龟子绿僵菌母药； 第2部分：金龟子绿僵菌油悬浮剂； 第3部分：金龟子绿僵菌可湿性粉剂。 本部分为NY/T3282的第1部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业农村部农药检定所、重庆大学、重庆重大生物技术发展有限公司。 本部分主要起草人：王中康、王晓军、殷幼平、杨峻、李向英、郭明程、胡丽。 行业标准信息服务平台 NY/T3282.1—2018 真菌微生物农药金龟子绿僵菌 第1部分：金龟子绿僵菌母药 1范围 本部分规定了金龟子绿僵菌母药的术语和定义、要求、试验方法、产品的检验和验收，以及标志、标 签、包装、储运、安全和保质期。 本部分适用于以分生孢子为主要成分的粉状金龟子绿僵菌母药。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T191包装储运图示标志 GB/T1601农药pH值的测定方法 GB/T1604商品农药验收规则 GB/T1605T 商品农药采样方法 GB3796农药包装通则 GB/T8170—2008数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T16150农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 金龟子绿僵菌母药Metarhiziumanisopliaetechnicalconcentrate(TK） 金龟子绿僵菌纯菌种经生物发酵获得的高含量的单一或组合形态的活菌体母药，通常情况还会包 含伴随发酵过程的相关生物组分。 3.2 分生孢子conidia 真菌的一种无性繁殖细胞，由分生孢子梗上产抱细胞产生，是真菌农药中最常见的形态，简称孢子。 3.3 含孢量 sporecontent 每单位金龟子绿僵菌母药样品中所含金龟子绿僵菌孢子的数量。 3.4 活孢率percentageof living spores 即孢子萌芽率，指在一定培养条件下，萌芽的金龟子绿僵菌孢子数占总孢子数的百分率。 3.5 菌落形成单位colonyformingunits（CFU） 以涂布方法，使单个分生孢子分散生长在营养琼脂培养基上，每一活孢子形成一个菌落，即为菌落 形成单位（CFU）。 NY/T3282.1—2018 3.6 杂菌率rateof microbial contaminants 金龟子绿僵菌母药样品中除绿僵菌孢子外，其他菌（真菌和细菌等）量占总菌量的百分率。 3.7 储存稳定性 Estorage stability 金龟子绿僵菌母药在室温或低于室温下密闭储存一定时间后，产品的活孢数占其标明值的相对百分率。 4要求 4.1外观 外观通常为浅绿色至暗绿色粉末，由于发酵基质的不同颜色偶有差异；应为均匀疏松的粉末，不应 有结块。 4.2规范项目及指标 金龟子绿僵菌母药质量控制项目应符合表1的要求。 表1金龟子绿僵菌母药控制项目指标 项 指标 含孢量，亿孢子/g >250 >85 活孢率，% 杂菌率，% 9V 干燥减量，% <8 细度（通过175μm试验筛），% ≥90 pH 5.5~7.0 储存稳定性，% ≥80 定期检测项目：每6个月检测一次。 5试验方法 5.1一般规定 除非另有说明，试验方法所用试剂级别为化学纯及以上，所用溶液均为水溶液。 5.2抽样 按照GB/T1605的规定进行样品的采集，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量不少于 200g。抽样时，从不同部位随机抽取至少3个样点的孢子粉，混合均匀。采样时，应特别注意样品的代 表性和避免污染，采集容器和采样工具应经过消毒灭菌。样品采集后，应立即检验，若不能立即检验，可 储存在4℃冰箱中。 5.3菌种鉴别 形态学特征观察：以划线或稀释涂布法将样品在萨氏培养基1/4SDAY上纯化培养，观察菌落形态 颜色或色素等特征。用显微镜观察菌丝体、产孢梗和分生孢子并测量大小，对比近源绿僵菌的形态学特 征描述进行鉴定。有效成分的特征描述参见附录A。 菌种鉴别采用形态学特征观察和分子鉴定相结合的方式进行。常规检测主要根据代表菌株的形态 学特征进行菌种鉴别。分子鉴定可采用核糖体rRNA基因序列或其他目标基因序列分析。菌种鉴别原 则与方法见附录B。 5.4含孢量测定 5.4.1方法提要 显微镜血球计数板计数法。将孢子样品加入吐温80溶液中，用高速匀浆器搅拌制成孢子悬浮液， NY/T3282.1—2018 并稀释至适当倍数K，后，在光学显微镜下用血球计数板直接计数孢子数，然后计算单位质量试样中的 真菌含孢量。 5.4.2试剂和溶液 吐温80。 0.1%吐温80溶液：（吐温80：水）=1：1000。 5.4.3仪器及设备 电子天平：精度为0.001g 光学显微镜：目镜×物镜400倍。 高速匀浆器：转速≥1000r/min。 超净工作台。 恒温培养箱。 亮线血球计数板：25X16规格。 微量移液器：0.2mL~1.0mL 手动计数器：1~9999。 容量瓶：100mL。 三角瓶：250mL。 5.4.4试验步骤 5.4.4.1将试样混均匀后，称取约1.0g（精确至0.001g）试样2份作为2个重复 5.4.4.2将每份试样置于洁净三角瓶中，先用5mL吐温80溶液润湿，再加人吐温80溶液60mL制成 孢子悬浮液并在高速匀浆器上搅拌5min（1000r/min），转移至100mL容量瓶中定容、摇匀，配制成A 悬浮液（稀释100倍）。 5.4.4.3用移液器准确吸取1.0mLA悬浮液至100mL容量瓶中，用吐温80溶液稀释至100mL（再 稀释100倍），并在高速匀浆器上混合均匀后备用 5.4.4.4在血球计数板上盖好盖玻片后，用微量移液器吸取5.4.4.3的孢子悬浮液，在盖玻片边缘滴 入，使液体沿边缘渗入盖玻片下，使其刚好充满盖玻片与计数板技术区域之间。应无气泡且计数区域四 周无液体，如有多余液体可用吸水纸吸去。 5.4.4.5用显微镜观察，待孢子静止后进行计数。在规划格区内，采取对角线5点取样的计数方法计 数。上下区域各5个中方格（16个小方格/中方格），即双线范围内160小方格（计数时，对于中方格四 周如有压线的孢子，计上双线不计下双线，计左双线不计右双线）的金龟子绿僵菌孢子数。 5.4.4.6每份试样点样计数p次（p=2）。 5.4.5测定结果 试样的含孢量W按式（1）计算。 KiX400XN WI= (1) 式中： W 试样的含孢量，单位为亿孢子每克（亿孢子/g）； K1 稀释倍数（10000倍）； Ni 力次计数的总抱子数（上下区域各5个中方格中计数的总抱子数）； 400 血球计数板计数室小方格总数为25×16=400； 160 血球计数板上下区域各5个中方格的小方格的总数（5X16×2=160）； 0. 1 血球计数板计数室体积，单位为立方厘米（mm）； 10-3 立方毫米换算为立方厘米（mL）的倍数； 3 NY/T3282.1—2018 计数次数（2次）； 试样质量，单位为克（g）； mr 108 代表108个孢子每克，即亿孢子每克。 5.4.6允许差 2次平行测定结果相对差应不大于10%，取其算术平均值作为测定结果 5.5活孢率测定 5.5.1玻璃纸片萌芽孢子显微计数法 5.5.1.1方法提要 将孢子悬浮液均匀涂在放有玻璃纸的1/4SDAY培养基上，然后在（25士1）℃下培养24h，制片镜 检。以孢子萌芽长度大于孢子长度的一半视为 数萌芽与未萌芽的孢子总数，计算孢子萌芽百分 率，即活孢率。 5.5.1.2试剂和溶液 萨氏培养基（1） SDA 京脂粉 18g溶人1000mL去 2Q0 离子水中。用精密 DH试 5MP 高压灭菌20min。 锥蓝（曲利苯 色液·馆 蓝 5.5.1.3仪器及设 人 电子天平 为 光学显微镜： 自镜X物 400 旋涡振荡 器 亮线血球 微量移液器 nLo 手动计数器 9 超净 高压灭菌 CEN 5.5.1.4测定步 5.5. 1. 4. 1 将高 取出 经为9cm的培 养皿中（每皿约 Rf 菌条件下放 cm的玻璃纸片 Y （高温灭菌）。 5.5.1.4.2将试样混 以下操作： a） 在含有0.0 包子 夜后，在涡旋振荡器中 混合均匀； b) 再用接种环蘸取配制好的孢子 璃纸片 后放人（25士1）℃恒温箱内 恒温培养24h； 用尖镊子分别取下3片玻璃纸片放 裁玻片上 锥蓝染色液滴于玻璃纸上，约3min c) 后盖上盖玻片（尽量避免气泡存在）； 在光学显微镜下观察并计数萌芽的孢子数与未萌芽的孢子数，计算其孢子萌芽百分率。每次 计数至少300个孢子。3次测定结果的平均值作为1份试样的测定结果。 5.5.1.5测定结果 试样的活孢率W²按式（2）计算。 Ni W2= X100 (2) N2 式中： W2- 试样的活孢率，单位为百分率（%）； 4 NY/T3282.1—2018 Ni