ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3278.3—2018 微生物农药 环境增殖试验准则 第3部分：植物叶面 Environmental reproduction test guidelinesfor microbial pesticides- Part3:Foliar surface 行业标准信息服务平台 2018-07-27发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3278.3—2018 前 言 NY/T3278《微生物农药环境增殖试验准则》，分为3个部分： 第1部分：土壤； 第2部分：水； 第3部分：植物叶面。 本部分为NY/T3278的第3部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业农村部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。 本部分主要起草人：谭丽超、周艳明、卜元卿、廖建华、袁善奎、姜辉、蒋金花、吕露。 行业标准信息服务平台 I NY/T3278.3—2018 微生物农药 环境增殖试验准则 第3部分：植物叶面 1范围 本部分规定了微生物农药植物叶面上增殖试验的材料、条件试验操作、数据处理、质量控制、试验 报告等的基本要求。 本部分适用于农药登记而进行的除病毒以外的微生 物在植物叶面上增殖试验。 2规范性引用文件 下列文件对于本文作 牛的应 凡是 日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件， 真最 版 （包括所有的修改单适 GB 15618 人 3术语和定义 S 下列术语和定义运 适用于本 文件 3. 1 A 微生物农药 micrQal pesticide 具有防 以细菌、真菌、病 毒和原生动物或基因修饰的微生物等活体为有效成分的农药 治病、虫、草、 鼠等有害生物作用。 工 3.2 供试物 testsubstance 试验中需要测试的物质 3.3 菌落形成单位 CFU 由单个菌体或聚集成团的多个菌在固体培养 3. 4 细菌芽孢 bacterial spore 某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成 个圆形或 圆形、厚壁、 水量极低、抗逆性极强的休 眠体。 3.5 真菌孢子 fungal spore 真菌的主要繁殖器官。分为有性孢子和无性孢子两大类。孢子在适宜条件下发芽，形成菌丝而进 行分裂繁殖；当外界环境不适宜时，可以呈休眠状态长时间生存。 3.6 细菌孢囊 bacterial cyst 某些细菌尤其是一些固氮菌在外界缺乏营养的条件下，由整个营养细胞外壁加厚、细胞失水而形成 的一种抗干旱但不抗热的圆形休眠体。 NY/T3278.3—2018 3.7 原生动物孢囊protozoancyst 某些原生动物在外界环境不利条件下，形成的能高度抵抗干旱、冰冻和高温的休眠体。 3.8 细菌营养体vegetativebacterium 单个活的生物体，通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。 3.9 原生动物protozoa 最原始、最低等的单细胞动物。原生动物除了具有真核细胞的一般特征（具细胞膜、细胞核和细胞 质等）外，其细胞本身是一独立完整的有机体，通过细胞内和细胞表面的一些特殊细胞器来完成运动、营 养和生殖等生命活动。 3.10 宿存survival 具有活性的微生物在施用后的一段时间内可在动物、土壤或植物内体或表面保持活性的状态。 3.11 增殖multiplication 微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生 命个体数量增加的生物学过程。 3.12 延滞期lagphase 少量微生物接种到新鲜培养基后，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，微生 物数目没有增加的一段时期。 3.13 指数期logphase 在生长曲线中，紧接着延滞期的一段微生物数量以几何级增长的时期 3.14 稳定期 stationary phase 新增殖的微生物数量与衰亡的微生物数量相等的时期，这个时期的菌体数量达到最高。 3.15 衰亡期deathphase 微生物的个体死亡速度超过新增殖速度，整个群体呈现负生长状态的时期。 4试验概述 将供试物喷施于植物叶面上，在适宜的条件下培养，定时取样测定其数量，得到供试物在植物叶面 上的动态变化。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1试验用植物 推荐棉花作为试验用植物，也可以选择生物农药登记作物或其他具有重要经济、生态价值的植物。 植物种子表面消毒后播种于人工基质或自然土壤，自然土壤符合GB15618二级标准的要求，放置在温 度、湿度、光照等条件适宜的温室或人工气候箱中，适时浇灌无菌水，待种子发芽生长至苗期（30d～ 2 NY/T3278.3—2018 40d)时，选择健康植株待用。 5.1.2供试物 5.1.2.1类型 供试物包括微生物农药母药、制剂产品。 5.1.2.2批次 试验中供试物应采用同一批次的产品。 5.1.3主要仪器设备 超净工作台。 磁力搅拌器。 灭菌锅。 显微镜。 分光光度计。 荧光定量PCR仪 温度计。 电子天平。 5.2试验操作 5.2.1处理组和对照组 5.2.1.1处理组 4个重复，每个重复8株一10株植 5.2.1.2对照组 日对照组 设置培养基空白 CR检测法还需设置供试物灭活对照组每组设 复海 每个重复 工 8株~10株植物 5.2.2接种量 接种浓度为 CFD ，若供试物因含量较低不能达到 10%CF 108 m 菌株接种浓度。推荐 宽施量 ，均匀地喷酒于叶片 面保证不 Z 5.2.3接种与培养 在超净工作台内 无菌水虾 活的植物放置于人工 气候箱中，适时浇灌无菌 特植物 供 温度、湿度、氧气、 光照等培养参数。上述 渗数的设定尚满足 用植物生长的要求 5.2.4取样 自接菌后第1d开始取样，前4每天取样 先取植物叶 片，无菌水振荡分离（涡 旋振荡器振荡10min），进行计数。 4d后每隔1d取一次样品。取样量和取样间隔时间可根据供试物 的具体生长情况调整。 5.2.5计数方法 5.2.5.1细菌、放线菌、真菌、酵母 以CFU为计数单位，可采用绿色荧光蛋白基因标记-平板计数法（参见附录A）测定。 以基因拷贝数为计数单位，可采用分子标记-荧光定量PCR法（参见附录B）测定。 5.2.5.2原生动物、真菌孢子、酵母 以个体数目为计数单位，可采用直接计数法（参见附录C）等测定。 5.2.6试验周期 试验持续时间应能够反映供试物的延滞期、指数期、稳定期和衰亡期，或在28d内检测到供试物数 3 NY/T3278.3—2018 量维持稳定或低于初始接种量，则可结束试验。 5.2.7生长-消亡曲线 以培养时间为横坐标、以供试物含量的对数为纵坐标做图，绘出供试物的生长-消亡曲线。 5.3数据处理 5.3.1独立样本t检验 2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式（1)计算。 X,-X2 t (1) + n-1 式中： "XX 分别为两样本平均数； 分别为两样本方差； n 样本容量。 5.3.2单因子方差分析(One-WayANOVA) 3组及以上均值比较时可进行方差分析。单因子方差分析LSD检验按式（2)计算 LSD=ta(df)S (2) 式中： ta(df.) 在F检验中误差自由度下，显著水平为α的临界t值； 均数差异标准误，按式（3）计算。 S-号=V2MS./m (3) 式中： MS. F检验中误差均方； m 各处理重复数。 5.4质量控制 使用荧光定量PCR法计数微生物数量时，扩增效率的范围应为90%~110%。 6试验报告 试验报告应包括下列内容，但不限于以下内容： 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号； a) b) 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况； c) 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期； 息服务平台 d) 供试物基本信息（如含量和组成信息，以及任何改变供试物生物活性物质的含量和组成信息、 施用量、施用方法等）； 试验系统的详细描述； 试验条件，包括试验温度、湿度、光照等； 试验结果，绘制供试物的生长-消亡曲线。 g) 4 NY/T3278.3—2018 附录A （资料性附录） 绿色荧光蛋白基因标记-平板计数法 A.1方法原理 将含有绿色荧光蛋白基因的质粒通过生物化学方法导人到供试物体内，转化后的供试物能够在紫 外透射下发出绿色荧光，而环境中其他微生物则不发绿色荧光，通过计数平板中的荧光菌落得到供试物 数量。 A.2试验材料 A.2.1月 胰蛋白陈。 A.2.2酵母浸出粉。 A.2.3 氯化钠。 A.2.4 马铃薯。 A.2.5 葡萄糖。 A.2.6 山梨酸。 A. 2.7 Tris -HCl。 A.2.8 氯化钙。 A.2.9 溶壁酶。 A.2.10 蜗牛酶。 A.2.11 抗生素。 A.2.12 聚乙二醇（PEG）。 A. 2. 13 转化缓冲液STC:1.0mol/L山梨酸，10mmol/LTris-HCl(pH7.5)，10mmol/LCaClz。 标准信息服务平台 A.2. 14 含绿色荧光蛋白基因的质粒。 A.3 仪器设备 A.3.1超净工作台。 A.3.2摇床。 A.3.3恒温水浴锅。 A.3.4低温高速离心机。 A.3.5恒温培养箱等。 A.4绿色荧光蛋白基因标记菌株的制备 A.4.1细菌 A.4.1.1细菌感受态细胞制备 取供试细菌划线接种在LB固体培养基（胰蛋白陈10g、酵母提取物5g、NaCI10g、