(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210385373.X (22)申请日 2022.04.13 (71)申请人 广东石油化工学院 地址 525000 广东省茂名市茂南区官渡二 路139号 (72)发明人 李桂银　陈敏　王超贤　周治德　 (74)专利代理 机构 桂林市华杰 专利商标事务所 有限责任公司 451 12 专利代理师 杨雪梅 (51)Int.Cl. G01N 27/327(2006.01) G01N 21/01(2006.01) G01N 21/33(2006.01) (54)发明名称 一种基于H-rGO-Mn3O4纳米酶的电化学/比 色双模式检测GP73的方法 (57)摘要 本专利提供一种基于H ‑rGO‑Mn3O4纳米酶的 电化学/比色双模式传感器检测高尔基体蛋白73 （GP73） 的方法， 采用纳米 金粒子 （Au  NPs） 修饰丝 网印刷电极， 将GP73适配体（Apt） 的互补链 （cDNA） 固定在电极表面； 将Apt固定H ‑rGO‑Mn3O4 纳米酶表面作为检测探针； 利用cDNA和GP73与检 测探针之间的竞争作用， 采用3,3',5,5' ‑四甲基 联苯胺 （TMB） 作为电化学和比色的双功能探针， 利用纳米酶催化信号放大方式， 构建了基于H ‑ rGO‑Mn3O4纳米酶的电化学/比色双模式适配体 传感器， 实现了对GP73的双信号检测， 最低检测 限为0.1 pg/mL。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 114813872 A 2022.07.29 CN 114813872 A 1.一种非诊断目的基于血红素 ‑还原氧化石墨烯 ‑四氧化三猛H ‑rGO‑Mn3O4纳米酶的电 化学/比色双模式检测GP73的方法， 按以下步骤进行： 步骤1： H‑rGO‑Mn3O4纳米酶的制备 （1） 将还原性氧化石墨烯rGO与血红素Hemin以1:1比例混合， 水浴反应， 离心洗涤， 得到 H‑rGO纳米复合材 料； （2） 在超纯水中加入氯化锰MnCl2·4H2O粉末和聚乙烯吡咯烷PVP， 室温下搅拌均匀； 加 热， 搅拌条件下加入NaOH溶 液， 搅拌， 离心， 洗涤， 得到 Mn3O4溶液； （3） 将1‑(3‑二甲氨基丙基) ‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐/N ‑羟基琥珀酰亚胺EDC/NHS添加 到H‑rGO溶液中， 在室温搅拌条件下添加Mn3O4溶液， 搅拌， 离心， 洗涤， 得到H ‑rGO‑Mn3O4纳米 酶； 步骤2： H‑rGO‑Mn3O4‑Apt检测探针的制备 取GP73适配体Apt和H ‑rGO‑Mn3O4纳米酶溶液超声震荡混合， 孵育， 离心， 洗涤， 得H ‑rGO‑ Mn3O4‑Apt检测探针； 步骤3： 电化学/比色双模式传感界面的构建 （1） 丝网印刷电极SPE在置放在H2SO4溶液， 采用循环伏安法CV扫描， 冲洗， 干燥， 得到活 化的SPE； （2） 将活化后的SPE置于氯金酸HAuCl4溶液中， 采用i ‑t技术进行恒电位沉积， 洗涤， 吹 干， 得到Au  NPs/SPE； （3） 在Au NPs/SPE表面滴加EDC/NHS溶液进行活化； （4） 在Au NPs/SPE表面上滴加补链适配体cDNA溶液， 孵育， 洗涤， 吹干， 得到cDNA/Au   NPs/SPE； （5） 将牛血清白蛋白BSA溶液添加到cDNA/Au  NPs/SPE表面， 孵育， 已阻断非特异性结合 位点， 洗涤， 吹干； （6） 滴加H ‑rGO‑Mn3O4‑Apt检测探针溶液到cDNA/Au  NPs/SPE表面， 恒温孵育， 洗涤， 吹干 备用； 得到 H‑rGO‑Mn3O4‑Apt/cDNA/Au NPs/SPE传感界面； 步骤4： 电化学/比色双模式检测GP73的工作曲线绘制 （1） 在步骤3得到的电化学传感界面上滴加GP73标准溶液， 孵育， 洗涤， 吹干， 得到GP73/ H‑rGO‑Mn3O4‑Apt/cDNA/Au NPs/SPE工作电极； 并将洗涤液收集于试 管中； （3） 将所制备好的工作电极置入包含H2O2和3,3',5,5' ‑四甲基联苯胺TMB的PBS缓冲液 中， 采用方波伏安法SWV 进行扫描， 记录传感器的响应电流值； 将H2O2+TMB混合液滴加在洗涤 液中， 反应， 采用紫外分光光度计在500  nm‑800 nm波长内进行扫描， 并记录652  nm处的吸 光度值； （4） 分别对不同浓度的GP73进行检测， 记录传感器的峰电流与吸光度值， 绘制工作曲 线， 计算出 该方法的最低检测限； 步骤5： 实际人 血清样本中GP73的检测 （1） 将实际人血清样本滴加在步骤3制备的传感界面上， 孵育， 洗涤， 得到工作电极， 晾 干备用； 并收集洗涤液于试 管中； （2） 将工作电极放入包含H2O2和TMB的PBS缓冲液中， 采用SWV技术和紫外分光光度计进 行扫描， 记录传感器的电流响应值与吸光度值；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114813872 A 2（3） 根据步骤3所 得的工作曲线， 计算待测实际血清样本中GP73的浓度。 2.按照权利要求1所述的方法， 其特征在于： 步骤1 （3） 中所述EDC/NHS添加到H ‑rGO溶液 中， 是将6 0.0 mg EDC 和15.0 mg NHS添加到15.0  mL H‑rGO溶液中； 所述Mn3O4溶液， 是指在50.0  mL的超纯水中加入445.0  mg的MnCl2·4H2O粉末和500.0   mg的PVP， 搅拌加热至90oC， 加入5.0  mL含200.0 mg的NaOH溶 液， 搅拌4  h； 离心洗涤得到 。 3.步骤2中所述的Apt浓度为3.0  μM； 所述H ‑rGO‑Mn3O4纳米酶浓度为1.0  mg/mL。 4.按照权利要求1所述的方法， 其特征在于： 步骤3、 步骤4和步骤5中所述孵育温度为 25oC； 所述孵 育时间为1  h； 所述PBS缓冲液浓度0.2  M、 pH值为6.5； 所述cDNA浓度为3 μM 。 5.按照权利要求1所述的方法， 其特 征在于： 步骤4和步骤5中， 所述的包含H2O2和TMB的PBS缓冲液为2  mM H2O2和5 mM TMB的PBS缓冲液； 所述H2O2+TMB 混合液浓度为10 0 mM H2O2和50 mM TMB； 所述的反应时间为10  min； 所述SWV检测条件： 扫描电位范围 ‑0.4  ‑  0.8 V， 振幅为0.025， 频率 为 25 Hz。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114813872 A 3